【摘要】：豬圓環(huán)病毒3型(Porcin circovirus trpe3)是能夠引起母豬和仔豬發(fā)病的一種新病毒,它是由豬圓環(huán)病毒所引起的。本病毒在美國(guó)首次被報(bào)道,本病與豬皮炎、腎病綜合征和生殖障礙以及心臟和多系統(tǒng)性炎癥有關(guān)。目前,在我國(guó)多省PCV3已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),隨著豬圓環(huán)病毒3型的流行強(qiáng)度及流行區(qū)域的不斷加強(qiáng)和擴(kuò)大給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的巨大的威脅并且給該病的防控工作帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。PCV3的ORF2基因比較保守,現(xiàn)有研究表明,PCV3與PCV2、PEDV、PRRSV的ORF2蛋白之間無(wú)交叉性反應(yīng)性。因此,本研究利用PCV3 ORF2基因構(gòu)建一種快速、特異的PCV3抗體檢測(cè)方法,對(duì)該病的防控具有積極意義。為了建立PCV3抗體間接ELISA檢測(cè)方法,本研究根據(jù)Gen Bank發(fā)表的PCV3-Cap基因序列,通過(guò)利用Primer 5.0軟件,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,應(yīng)用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增獲得一條540 bp的基因片段,然后將其克隆到p MD19-T克隆載體中,通過(guò)雙酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果的分析比較,結(jié)果顯示,該基因序列與Gen Bank發(fā)表的PCV3-Cap基因核苷酸序列同源性高達(dá)99%。根據(jù)Cap基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)基因序列,利用Primer 5.0軟件,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性表達(dá)引物,以重組質(zhì)粒p MD19-T-Cap為模板擴(kuò)增得到一條540 bp的基因片段,將其克隆至p ET-32a(+)表達(dá)載體,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-32a(+)-Cap,將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)。含重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-32a(+)-Cap的菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示重組蛋白表達(dá)分子量為38 KD,和預(yù)期的大小一致。利用His標(biāo)簽純化重組蛋白,SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示純化效果較好,沒有雜帶。Western-blotting鑒定表明,純化的重組蛋白具有良好的抗原性。將純化的重組蛋白作為包被抗原,通過(guò)優(yōu)化各部分反應(yīng)條件,建立了血清中PCV3 IgG抗體間接ELISA檢測(cè)方法。血清中PCV3 IgG抗體間接ELISA檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件:抗原包被濃度為2.5μg/m L,37℃孵育2 h后4℃包被過(guò)夜;血清稀釋度為1:100,37℃作用1 h;酶標(biāo)二抗稀釋度為1:10000,37℃作用1 h;底物最佳顯色時(shí)間為15min。建立的間接ELISA檢測(cè)方法不與TGEV、CSFV、PRV、PRRSV陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)均不大于10%。特異性為100%、敏感性為91.5%,表明建立的間接ELISA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高,為PCV3 IgG抗體檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便快速的血清學(xué)診斷方法。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 曲連東;豬圓環(huán)病毒2型地方株的分離鑒定和診斷方法的建立及應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：2614184