【摘要】：犢牛腹瀉是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失的原因之一。本試驗前期通過體外抑菌和小鼠體內(nèi)抗菌試驗初步確定了酸馬奶源乳酸桿菌代謝物(MLP)的作用效果,為后期研究犢牛腸黏膜屏障的作用提供參考依據(jù)。試驗1,通過分離鑒定、體外抑菌和SPF小鼠抗菌試驗證明了酸馬奶源乳酸桿菌具有抑菌效果,并測定其分子量大小和氨基酸組成。試驗2,選取60 只 SPF小鼠,隨機分為健康組、腹瀉組、氨芐青霉素組、環(huán)丙沙星組、Nisin組和MLP組。除健康組外,其余5組分別灌胃滅菌生理鹽水、氨芐青霉素(0.001 g/kg)、環(huán)丙沙星(0.13 g/kg)、Nisin(0.002 g/kg)和 MLP(0.125g/mL),連續(xù) 15d,2 次/d,并于第 5d末次給藥30 min后腹腔注射濃度為0.5× 10~9 CFU/mL的致病性EcoliO1,再繼續(xù)灌胃10 d。試驗結(jié)束后,采集樣品,進行微生物-腦-腸軸相關指標檢測,研究MLP對感染致病性EcoliO1小鼠微生物-腦-腸軸的作用。試驗3,選取20頭荷斯坦犢牛,除自然組外,其余3組犢牛經(jīng)口服接種致病性E.coli O1(2.50 × 10~11 CFU/mL,100 mL/頭)建立腹瀉模型,造模3 d后,將滅菌生理鹽水、0.5 mg/kg環(huán)丙沙星和200 mL MLP試驗樣品混于酸化奶中連續(xù)飼喂15 d,2次/d。試驗結(jié)束后,采集血液分離血清,收集回腸、瘤胃液、盲腸、結(jié)腸樣品進行相關指標檢測,研究MLP對感染致病性E.coliO1犢牛腸黏膜屏障的作用機制。研究結(jié)果表明,試驗1:從酸馬奶中分離鑒定出4株乳酸桿菌,在屬的水平上與乳酸桿菌標準菌株相似度達到97.80%,確定為乳酸桿菌并命名為:Lactobacillus.P。通過體外試驗確定MLP的最小抑菌濃度(MIC)為62.50mg/mL。MLP中含有豐富的脯氨酸,并測得MLP的分子量在1000 Da以下占到76.46%,確定為細菌素。試驗2:MLP使空腸中血小板反應蛋白1和總膽固醇的濃度顯著增加,使回腸中胰島素含量顯著降低(P0.05)。MLP可顯著增加Lactobacillus的豐度,顯著降低Proteobacteria的豐度(P0.01),對調(diào)節(jié)腸道菌群的動態(tài)平衡具有一定的作用。試驗3:①腹瀉組犢�；啬c絨毛變短、水腫、斷裂脫落、肌層厚度減少;而MLP組犢牛腸絨毛排列整齊、緊密,腸黏膜完整,更加接近于自然組。②與自然組、腹瀉組和環(huán)丙沙星組相比,MLP顯著增加血清中IgA、IgG、CD4、IFN-γ的水平,顯著增加回腸組織中adamtsl、TC和INS以及犢牛體重,顯著增加結(jié)腸中Claudin-1、Occludin和JAM-1的濃度;顯著降低TNF-α和IL-6的水平,從而增強腸黏膜免疫屏障和機械屏障功能。③通過16S rDNA對瘤胃液、盲腸和結(jié)腸微生物測序表明:MLP和環(huán)丙沙星一方面增加盲腸、降低結(jié)腸中OTUs數(shù)量;另一方面,顯著增加Porphyronzonas的豐度,顯著降低瘤胃液中Helicobacter、盲腸中Faecalibacterium和結(jié)腸中Fusobacterium的豐度;從而提高胃腸道黏膜微生物屏障功能。綜上所述,MLP可有效改善致病性E.coli O1腹瀉性犢牛的免疫力和胃腸道微生物菌群。MLP在改善動物健康和增強免疫力上與動物菌群豐富度有關,口服益生菌代謝物是通過調(diào)節(jié)胃腸道微生物群來增強腸黏膜免疫屏障的有效途徑之一,我們的工作為益生菌代謝物以改善動物和人類健康提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

圖１技術路線圖逡逑Ｋｉｇ．邋Ｉ邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｄｒａｗｉｎｇ逡逑

具有代表性的細菌ＯＴＵｓ序列。通過ＲＤＰ和Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ數(shù)據(jù)庫同源性比對發(fā)現(xiàn)約逡逑有５．６７％無法鑒定到屬的水平，約有７．８３％無法確定到種的水平。在屬的水平上，，逡逑分離株與乳酸桿菌標準菌株相似度達到９７．８０％邋（圖２）�；冢郑澹睿顖D分析表明，逡逑標準菌株（ＬＰ１）有１０１個特有ＯＴＵｓ序列，酸馬奶中分離的乳酸桿菌組（ＬＰ２）有逡逑１０８個特有ＯＴＵｓ序列，而所有樣本中所共有４０１個ＯＴＵｓ序列（圖３），從而確定逡逑試驗所分離的菌株為乳酸桿菌，命名為：心ｃ／／／ｗ．ｖ．Ｐ。逡逑表４疑似乳酸桿菌分離株的１６Ｓ邋ｒＤＮＡ鑒定逡逑Ｔａｂｌｅ．４邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋１６Ｓ邋ｒＤＮＡ邋ｏｆ邋ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ邋Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ逡逑樣品編號邋序列（條）邋ＯＴＵ邋（個）門（個）綱（個）目（個）科（個）屬（個）種（個）逡逑ＬＰ１－１邐７１９８２邐１９２邐１０邐３邐４７邐８０邐８４邐２２逡逑ＬＰ１－２邐７０３４０邐１９２邐１０邐１邐４７邐８０邐８４邐２２逡逑ＬＰ２－１邐６９８３６邐１９２邐１０邐１邐４７邐８０邐８４邐２２逡逑ＬＰ２－２邐７１６３３邐１９２邐１０邐３邐４７邐８０邐８４邐２２逡逑ｉｎ逡逑Ｉ邐＿＿ｌ逡逑■邋Ｆｕｓｉｃａｔ？ｎｉ0ａｃｔｃｒ逡逑■邋Ｆ＊ｅｃ＊ｌｉｂ？ｃｔｅ
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

【參考文獻】

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本文編號：2614183