【摘要】：安乃近(Dipyrone)又名羅瓦爾精,是一種吡唑酮類的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥,使用至今已有近百年的歷史。近年來,各類藥品的毒副作用漸漸引起人們的注意,自上世紀(jì)七十年代以來各國對安乃近的臨床深入研究發(fā)現(xiàn),在使用人群中有大量患者的毒副作用較為嚴(yán)重,甚至危及生命。因此,許多發(fā)達(dá)國家開始漸漸減少安乃近的使用直至禁用,盡管如此,部分地區(qū)安乃近的使用量依然很大。我國早在1982年就將復(fù)方安乃近片列為禁止使用的藥品,但安乃近片劑及注射劑等至今仍在使用。針對日趨嚴(yán)重的動物性食品獸藥殘留問題,如何篩選含有殘留物的動物性食品,避免其進(jìn)入市場至關(guān)重要,其中檢測分析手段是必不可少的一環(huán)。目前針對安乃近及其代謝產(chǎn)物殘留的分析方法主要是一些理化分析法,這些檢測方法雖準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)但需要使用的儀器價格昂貴、樣品前處理過程復(fù)雜、操作復(fù)雜、耗時長、且對操作人員的專業(yè)水平有一定要求,無法在基層機(jī)構(gòu)普及。而免疫學(xué)檢測法是基于抗原抗體特異性反應(yīng)原理的一種快速檢測分析方法,相比于理化分析法,該方法使用方便,檢測過程快速高效,檢測結(jié)果準(zhǔn)確,適用于大量樣本的檢測。本試驗(yàn)旨在建立一種快速檢測安乃近殘留的免疫學(xué)分析方法,為安乃近在動物源性食品殘留監(jiān)控及檢測上提供科學(xué)依據(jù)。1.安乃近人工抗原的制備及鑒定安乃近進(jìn)入機(jī)體后迅速分解,血漿中無法檢測出安乃近原型藥成分,故本試驗(yàn)針對安近的代謝產(chǎn)物4-氨基安替比林進(jìn)行研究。4-氨基安替比林是小分子化合物,本試驗(yàn)采取戊二醛兩步合成法將4-氨基安替比林分別與載體牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備出了兩種人工抗原,分別作為免疫原(AA-BSA)和包被原(AA-OVA)。經(jīng)紫外分光光度法與免疫學(xué)方法進(jìn)行判定,結(jié)果證明人工抗原偶聯(lián)成功。2.安乃近單克隆抗體的制備及鑒定使用人工抗原AA-BSA作為免疫原接種小鼠,在第五次免疫后采集、制備小鼠血清并進(jìn)行間接ELISA檢測,結(jié)果血清中效價可達(dá)1:256000。通過單克隆抗體技術(shù),在免疫程序結(jié)束后取血清效價高的小鼠脾臟細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)融合,經(jīng)過三次亞克隆,篩選出兩株雜交瘤細(xì)胞株分別命名為3B6、7G6。通過進(jìn)一步篩選后將7G6單克隆細(xì)胞株注入小鼠腹腔,利用體內(nèi)誘生法共制得腹水16mL,通過BCA法測定化前腹水的蛋白濃度為24.32 mg/mL,純化后的腹水蛋白濃度為0.72 mg/mL,通過SDS-PAGE檢測腹水純化效果,結(jié)果表明腹水純化效果良好。藥物交叉試驗(yàn)結(jié)果顯示,該AA單克隆抗體恩諾沙星、頭孢氨芐、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、BSA和OVA無明顯的交叉反應(yīng),與安乃近交叉反應(yīng)率為86.3%,與安乃近代謝產(chǎn)物4-甲氨基安替比林的交叉反應(yīng)率為79.1%。3.ELISA檢測方法的建立優(yōu)化ELISA檢測方法中的各項(xiàng)條件,確定2%明膠溶液為最佳封閉液,抗原抗體最佳工作濃度分別為1:3000和1:16000。ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線線性方程為y=0.2894x-0.1085,相關(guān)系數(shù)R2=0.995,AA藥品濃度在10～5000 ng/mL時線性關(guān)系良好,經(jīng)過相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算得出:藥物的 IC50為 120.79 ng/mL,LOD 為 7.1 ng/mL,LOQ 為 51.76 ng/mL。4.豬肉中AA添加回收試驗(yàn)本試驗(yàn)設(shè)置豬肉樣品并通過相關(guān)步驟對豬肉樣品進(jìn)行前處理,樣品溶液稀釋16倍時可以排除樣品基質(zhì)的干擾。通過競爭抑制曲線的繪制可以看出藥物濃度在20～2000 ng/mL時線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=0.3489x-0.2311,相關(guān)系數(shù)R2=0.9907,藥物半數(shù)抑制濃度 IC50 為 124.58 ng/mL,LOD 為 9.52 ng/mL,LOQ 為 22.68 ng/mL。設(shè)置三個藥品濃度梯度分別為50 ng/mL、400 ng/mL和800 ng/mL進(jìn)行添加回收試驗(yàn),最后計(jì)算出豬肉樣品中4-氨基安替比林的添加回收率在87.70%～101.57%。
【圖文】：

圖２－１戊二醛法制備人工抗原路線逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｙ邋ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ逡逑１．５．３包被原的合成逡逑包被原的合成同１．５．２介紹的方法，將４－氨基安替比林與大分子載體蛋白ＯＶＡ進(jìn)行偶逡逑聯(lián)，在最后一步加入過量的甘氨酸以封閉未反應(yīng)的醛基。逡逑１．６人工抗原的分析逡逑１．６．１人工抗原蛋白濃度的測定逡逑本試驗(yàn)采用ＢＣＡ法測定完全抗原ＡＡ－ＢＳＡ、ＡＡ－ＯＶＡ的蛋白濃度，方法如表２－１所示，逡逑具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：逡逑（１）按照試劑盒說明要求將蛋白溶液配制成試驗(yàn)所需的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（０．５邋ｍｇ／ｍＬ），逡逑并使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液吸�。啊ⅲ�、１０、２０、４０、６０、８０、１００邋ｈＬ加入到９６孔板中。逡逑（２）各孔加入ＰＢＳ溶液，每孔總體積為１００邋ｎＬ，使用移液器緩慢吹打每孔使各孔液逡逑體混合均勻。從各孔吸�。玻板澹瑁倘芤悍謩e加入到三個空白孔中。逡逑（３）將合成的人工抗原溶液稀釋成蛋白濃度為０？０．５邋ｍｇ／ｍＬ的區(qū)間內(nèi)并加入每孔２０逡逑

２結(jié)果逡逑２．１人工抗原蛋白濃度的測定結(jié)果逡逑根據(jù)試驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２－２所示，線性方程為ｙ＝０．９５５１Ｘ－０．１１１，相逡逑關(guān)系數(shù)Ｒ２為０．９９６３，將相關(guān)數(shù)據(jù)代入公式計(jì)算得出，ＡＡ－ＢＳＡ蛋白濃度為５．７３邋ｍｇ／ｍＬ，逡逑ＡＡ－ＯＶＡ邋蛋白濃度為邋６．６１邋ｍｇ／ｍＬ。逡逑０．６邋ｒ逡逑０．５邋－邐＞逡逑＃４邋－邐ＪＴ逡逑Ｉ５邋０．邋３邋－逡逑]
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【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S859.84

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本文編號：2613866