發(fā)布時(shí)間：2020-04-03 19:21

【摘要】：脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一,腸道內(nèi)的陰性菌溶解后可釋放大量的LPS進(jìn)入血液或由門靜脈進(jìn)入肝臟,對(duì)雛雞的肝臟和脾臟等組織造成損傷,破壞雛雞的免疫系統(tǒng),影響雛雞的生長(zhǎng)性能和免疫功能,甚至導(dǎo)致雛雞死亡,給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。二氫楊梅素(DHM)是一種類黃酮化合物,其結(jié)構(gòu)明確,存在于多種植物中,具有清除氧自由基、抗氧化和抗炎等多種生理活性,在畜牧業(yè)發(fā)展中擁有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)以海蘭白雛雞為研究對(duì)象,在雛雞飼料中添加不同劑量的DHM,研究其對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響及對(duì)LPS誘導(dǎo)雛雞肝脾損傷的保護(hù)作用,為DHM在獸醫(yī)臨床上的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)內(nèi)容如下:(1)研究DHM對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響:1日齡雛雞適應(yīng)性飼喂7 d,于雛雞7日齡時(shí)進(jìn)行新城疫疫苗免疫,然后將雛雞分為五組,在飼料中添加不同劑量(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%)的DHM,連續(xù)飼喂35 d。每周稱量雛雞空腹體重,計(jì)算平均日增重(ADG)和平均料重比(F/G);稱量體重后心臟采血分離血清,剖取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺和法氏囊進(jìn)行稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。采用生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、直接膽紅素(DBIL)、鈣(Ca)和磷(P)的含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)的活性;ELISA法檢測(cè)血清中IgG、IL-2、IFN-γ含量;血凝抑制法檢測(cè)血清中新城疫抗體效價(jià);將肝臟的部分組織進(jìn)行勻漿,采用試劑盒檢測(cè)肝臟勻漿中總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)含量。(2)研究DHM對(duì)雛雞肝臟和脾臟中TLR2、TLR4及炎性因子mRNA表達(dá)的影響:將7日齡雛雞分為五組,在飼料中添加不同劑量(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%)的DHM,連續(xù)飼喂35 d。于雛雞43日齡時(shí),頸動(dòng)脈放血處死雛雞,分離肝臟和脾臟組織,用于提取總RNA,RT-PCR法檢測(cè)雛雞肝臟和脾臟中TLR2、TLR4及炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α)mRNA的表達(dá)。(3)研究DHM對(duì)LPS誘導(dǎo)雛雞肝脾損傷的保護(hù)作用:將7日齡雛雞分為五組,在飼料中添加不同劑量(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%)的DHM,連續(xù)飼喂14 d。于雛雞22日齡時(shí),模型組和DHM添加組腹腔注射LPS(60 mg/kg),對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水,注射12 h后收集血液和肝脾組織,檢測(cè)血清中ALT、AST和LDH活性及DBIL、TC和TG的含量;肝臟和脾臟的部分組織用于提取總RNA和蛋白,RT-PCR法檢測(cè)雛雞肝臟和脾臟中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65及炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α)mRNA的表達(dá),western blot法檢測(cè)肝脾組織中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平;肝臟和脾臟的部分組織用于制作石蠟切片和透射電鏡切片,觀察肝脾組織形態(tài)和超微形態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)DHM對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能影響結(jié)果:與對(duì)照組相比,0.05%DHM顯著增加28日齡、35日齡和42日齡的雛雞體重(p0.05或p0.01),增加7-21日齡雛雞的ADG并降低22-42日齡雛雞的F/G;在0.05%DHM添加組中,35日齡雛雞血清中TC和TG含量顯著高于對(duì)照組(p0.05),不同日齡雛雞血清中GLU含量顯著高于對(duì)照組(p0.05或p0.01),14日齡、21日齡和28日齡雛雞血清中LDH活性和14日齡雛雞血清中DBIL含量顯著低于對(duì)照組(p0.05或p0.01)。(2)DHM對(duì)雛雞免疫功能影響結(jié)果:在0.05%DHM添加組中,14日齡雛雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)及42日齡雛雞的脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組(p0.05或p0.01);與對(duì)照組相比,0.025%、0.05%和0.1%DHM分別明顯提高了21日齡雛雞的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)(p0.05或p0.01);在0.025%、0.05%和0.1%DHM添加組中,14日齡雛雞血清中IL-2、IFN-γ和IgG含量極顯著高于對(duì)照組(p0.01),0.05%DHM添加組中,21日齡雛雞血清中IL-2、IFN-γ和IgG含量極顯著高于對(duì)照組(p0.01);0.05%、0.1%和0.2%DHM添加組中,14日齡、28日齡和42日齡雛雞血清中的新城疫抗體效價(jià)均明顯高于對(duì)照組(p0.05或p0.01);在0.025%和0.05%DHM添加組中,21日齡和42日齡雛雞肝臟內(nèi)的GSH-Px和A-TOC活性顯著高于對(duì)照組(p0.05或p0.01),0.05%DHM提高21和42日齡雛雞肝臟內(nèi)SOD活性,與對(duì)照組相比差異顯著(p0.05)。(3)RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,0.05%和0.1%DHM可明顯促進(jìn)肝臟中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA表達(dá),明顯抑制肝臟中TLR2和TNF-α的mRNA表達(dá)(p0.05或p0.01);與對(duì)照組相比,0.05%和0.1%DHM可顯著促進(jìn)脾臟中TLR2、TLR4和TNF-α的mRNA表達(dá),顯著抑制脾臟中IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA表達(dá)(p0.05或p0.01)。(4)腹腔注射LPS后,雛雞血清中AST、ALT和LDH活性及DBIL、TG含量顯著高于對(duì)照組(p0.05或p0.01),0.05%DHM可極顯著降低雛雞血清中AST和ALT及LDH活性及DBIL和TG含量(p0.01)。(5)腹腔注射LPS后,與對(duì)照組相比,TLR2的mRNA表達(dá)在肝臟和脾臟中均顯著升高(p0.05或p0.01),TLR4的mRNA表達(dá)在脾臟中極顯著降低(p0.01),MyD88和NF-κB p65的mRNA表達(dá)在肝臟中極顯著降低而在脾臟中極顯著升高(p0.01),其中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平在肝臟中無顯著變化,而在脾臟中極顯著降低(p0.01);IL-1β和IL-8的mRNA的表達(dá)在肝臟和脾臟中升高顯著(p0.05或p0.01),IL-6的mRNA表達(dá)在肝臟中極顯著降低(p0.01),IL-10的mRNA表達(dá)在肝臟和脾臟中均極顯著降低(p0.01),TNF-α的mRNA表達(dá)在肝臟中升高極顯著(p0.01)。與模型組相比,0.05%或0.1%DHM可極顯著降低肝臟中TLR2、IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)(p0.01),顯著升高肝臟中TLR4、MyD88、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)(p0.05或p0.01),DHM的添加對(duì)肝臟中NF-κB p65的mRNA表達(dá)及其磷酸化水平無顯著影響;0.025%DHM可顯著降低脾臟中TLR2的mRNA表達(dá)(p0.05),極顯著升高脾臟中IL-10的mRNA表達(dá)(p0.01),0.05%DHM可顯著升高脾臟中TLR4、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)(p0.01),0.05%和0.1%DHM可明顯降低脾臟中MyD88、IL-1β和IL-8的mRNA表達(dá)(p0.05或p0.01);在DHM(0.05%和0.1%)添加組中,脾臟中NF-κB p65的mRNA顯著降低(p0.01),而NF-κB p65蛋白的磷酸化水平極顯著升高(p0.01)。(6)形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示,雛雞腹腔注射LPS后,肝臟組織中細(xì)胞腫脹,肝索結(jié)構(gòu)紊亂且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),脾臟組織中白髓和紅髓界限模糊;超微形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有大量空泡形成,而脾臟細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有少量空泡形成。在雛雞飼料中添加0.05%和0.1%DHM可減輕肝臟和脾臟的損傷情況,緩解LPS對(duì)雛雞肝臟和脾臟組織造成的損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在海蘭白雛雞飼料中添加DHM,可促進(jìn)雛雞體重的增加,改善雛雞的生化指標(biāo),增加血清中抗體和細(xì)胞因子含量,調(diào)節(jié)雛雞肝臟和脾臟中TLR2、TLR4和炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α)mRNA的表達(dá);DHM可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65和炎性因子mRNA在雛雞肝臟和脾臟中的表達(dá),以及肝脾組織中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平,改善雛雞肝脾組織的損傷程度。綜上可知,0.05%DHM可提高雛雞的生長(zhǎng)性能和免疫功能,緩解LPS對(duì)雛雞造成的肝脾損傷。
【圖文】：

二氫楊梅素結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Thestructuralformulaofdihydromyricetin

圖 3-1 DHM 對(duì)雛雞平均日增重和料重比的影響（n=10）Fig. 3-1 Effect of DHM on average daily gain and feed to gain ratio of chicks（n=10）3.1.3 DHM 對(duì)雛雞血清生化指標(biāo)的影響3.1.3.1 雛雞血清中總蛋白和白蛋白的含量變化
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S831.5

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本文編號(hào)：2613598