【摘要】：貓免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus,FIV)和人類免疫缺陷病毒同屬反轉(zhuǎn)錄病毒科,慢病毒屬成員,主要引起貓科動(dòng)物的免疫缺陷疾病。感染了貓免疫缺陷病毒的個(gè)體可以在數(shù)年內(nèi)無任何癥狀,在其發(fā)病初期主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞減少、口腔炎癥、鼻炎、食欲不振及體型瘦弱。FIV感染發(fā)生在全世界范圍,自1985年首次發(fā)現(xiàn)以來,己在美國、日本、加拿大等國流行。貓艾滋病病毒有較強(qiáng)突變性,不同地區(qū)分離的毒株均有差異。本實(shí)驗(yàn)以貓免疫缺陷病毒陽性全血所提DNA為材料,對FIV gag基因p24片段進(jìn)行分子克隆、原核及真核表達(dá)和多克隆抗體制備,為后期FIV血清學(xué)檢測方法的建立奠定一定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)取得結(jié)果如下:根據(jù)GenBank上貓免疫缺陷病毒全基因RNA序列(Accession:NC_001482.1),設(shè)計(jì)了 p24蛋白編碼區(qū)的一對引物,首先從血清學(xué)檢測為陽性的貓血液樣本中提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,再利用PCR方法擴(kuò)曾p24基因,成功獲得了 622bp的目的片段,編碼207個(gè)氨基酸,經(jīng)測序后與GenBank提供的序列同源性達(dá)到98%。亞克隆后酶切及PCR驗(yàn)證正確后將帶粘性末端的目的片段連接到表達(dá)載體pET-28a(+),成功構(gòu)建pET-28a-p24重組原核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3),經(jīng)SDS-PAGE和免疫印跡(Western-blot)鑒定顯示重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá),且能夠與抗His標(biāo)簽小鼠單克隆抗體發(fā)生反應(yīng),證明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的原核表達(dá)載體能夠成功表達(dá)p24蛋白。原核表達(dá)重組菌經(jīng)過大量誘導(dǎo)表達(dá)后,利用切膠電洗脫純化獲得p24蛋白,純化的p24蛋白與等量弗氏完全佐劑充分混合后對小鼠進(jìn)行腹腔注射。之后用弗氏不完全佐劑混合純化蛋白進(jìn)行另外三次加強(qiáng)免疫,總共四次免疫后獲得了具有較高特異性的多克隆抗體。通過間接ELISA方法檢測多克隆抗體效價(jià),結(jié)果顯示效價(jià)可達(dá)1:51200。為了能夠?qū)⒛康钠芜B接到pCMV-HA真核表達(dá)載體,需要設(shè)計(jì)一組具有不同酶切位點(diǎn)的引物。將亞克隆鑒定正確的目的片段連接到pCMV-HA載體,構(gòu)建p24基因真核表達(dá)載體pCMV-HA-p24。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中。經(jīng)空載體轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞作為對照組,Western-blot方法檢測p24蛋白的免疫學(xué)活性。此部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pCMV-HA-p24真核表達(dá)載體,構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫熒光檢測結(jié)果顯示篩選出的HEK-293T-p24細(xì)胞系大多數(shù)細(xì)胞能夠顯示綠色熒光而作為對照的HEK-293T細(xì)胞則不顯示熒光,能夠說明p24蛋白在HEK-293T-p24細(xì)胞系中成功且高效表達(dá)。真核表達(dá)的特點(diǎn)是所表達(dá)的蛋白一旦表達(dá)成功即擁有相應(yīng)的生物學(xué)活性,所以真核表達(dá)的p24蛋白在本實(shí)驗(yàn)用作檢測鼠源多克隆抗體特異性的檢測蛋白。
【圖文】：

以ＦＩＶ陽性流浪貓的全血提取的總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄所得的ｃＤＮＡ為模板，設(shè)計(jì)了一組逡逑帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，成功擴(kuò)增出了邋ＨＶ邋ｇａｇ基因ｐ２４片段。片段大�。叮玻插澹猓穑瑮l逡逑帶位置符合目的片段大小。電泳結(jié)果見圖３－１。逡逑Ｍ邋１邐２逡逑ｒ＇Ｄ邋３邋＇逡逑■ＩsE逡逑７５０邋ｂｐ逡逑５００邋ｂｐ邐４６２２邋ｂｐ逡逑２５０邋ｂｐ邋ｔ逡逑１００邋ｂｐ逡逑Ｍ．邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋（ＤＬ２０００），，ｌ．ＰＣＲ邋產(chǎn)物，２．陰性對照逡逑圖３－１邋ｐ２４基因的ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ２４邋ｇｅｎｅ逡逑３．１．１．２亞克隆重組質(zhì)粒的鑒定逡逑將ＰＣＲ擴(kuò)增得到的目的片段連接到克隆載體ｐＭＤｌ８－Ｔ上，亞克隆組質(zhì)粒經(jīng)限制逡逑性核酸內(nèi)切酶ＥｃｏＲＲＳａｌｌ雙酶切后成功獲得了邋６２２邋ｂｐ的目的片段和２６９２邋ｂｐ的載體片逡逑段，電泳結(jié)果見圖３－２。對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序的結(jié)果顯示０的片段序列與Ｇｅｎ邋Ｂａｎｋ提供逡逑的參考序列完全匹配，無缺失與突變。逡逑ｓ：：：逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋（ＤＬ５０００）邋，邋１邋？邋２．載體片段與目的片段逡逑－２３－逡逑

逡逑圖３－２亞克隆Ｍ組質(zhì)粒雙＿切鑒定逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄｓ邋ｂｙ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑Ｍ組質(zhì)粒ＰＣＲ鑒定結(jié)果見圖３－３。逡逑Ｍ邋１逡逑２°。°邋ｂＰ逡逑１０００邋＾逡逑７５０邋ｂＰ邐．邐６２２邋ｂｐ逡逑５邋００邋ｂｐ邋ＭｗＨｆｒｆｆ－－邋■，逡逑２５°ｂｐ逡逑１００邋ｂｐ逡逑Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋（ＤＬ２０００）邋，邋Ｉ．質(zhì)粒邋ＰＣＲ邋產(chǎn)物逡逑圖３－３亞克隆重組質(zhì)粒ＰＣＲ鑒定逡逑Ｆｉｇ．３－３邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑３．１．２原核表達(dá)重組質(zhì)粒的酶切鑒定逡逑原核表達(dá)重組質(zhì)粒ｐＥＴ－ｐ２４經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶ＥｃｏＲＩ＋Ｓａｌｌ雙酶切后成功獲得了逡逑６２２邋ｂｐ的目的片段和５３６９邋ｂｐ的載體Ｋ段，電泳結(jié)果見圖３－４。結(jié)果表明目的片段正確逡逑連入原核表達(dá)載體。逡逑Ｍ邋１邐２逡逑７Ｓ５000ｂｂＰｐｆｅ＾Ｈ＾２２ｂｐ逡逑Ｍ．ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋（ＤＬ５０００）邋，邋１．２．載體片段與目的片段逡逑圖３－４原核表達(dá)重組質(zhì)粒ｐＥＴ－ｐ２４的雙酶切鑒定逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＥＴ－ｐ２４邋ｂｙ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑－２４－逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 景龍;李立輝;鄭世民;;動(dòng)物艾滋病研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年05期

2 李樂;苗海生;李華春;;貓免疫缺陷病毒在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年S1期

本文編號：2611459