【摘要】：免疫佐劑是指可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì),添加到疫苗中可延緩抗原的降解,提高免疫強(qiáng)度,減少抗原使用量;或增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞對抗原的處理和提呈能力;刺激淋巴細(xì)胞增殖分化;促進(jìn)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子等,因而在疫苗中具有廣闊的市場前景。理想的免疫佐劑能夠在較少用量下刺激機(jī)體產(chǎn)生高效免疫應(yīng)答,且自身無毒副作用,便于生產(chǎn)和使用�，F(xiàn)有的獸用佐劑因不易代謝或易引起不良反應(yīng)等缺點(diǎn)而越來越不滿足市場的要求,因而亟需開發(fā)新型無毒副作用的佐劑。殼聚糖為具有一定免疫活性的天然多糖,生物相容性好、無毒且資源豐富,但由于在水中的不溶性限制了其應(yīng)用,而其衍生物如殼聚糖季銨鹽、殼聚糖硫酸酯具有良好的水溶性。因此,本文制備了不同分子量的α、β型殼聚糖及其水溶性衍生物——?dú)ぞ厶橇蛩狨ズ蜌ぞ厶羌句@鹽,并采用紅外光譜、核磁共振一維、二維波譜、高效液相色譜等分析手段對其理化性質(zhì)進(jìn)行全面解析,確定了其取代位置;通過免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)篩選出免疫效果好的衍生物,并將衍生物制備成納米粒,開發(fā)具有免疫刺激和抗原遞送作用的新型免疫佐劑。主要研究結(jié)果如下:1)成功制備了不同分子量的α、β-殼聚糖、殼聚糖硫酸酯和殼聚糖季銨鹽衍生物。并以RAW 264.7細(xì)胞為模型進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn)及免疫機(jī)制研究。首先通過細(xì)胞的一氧化氮產(chǎn)生量和細(xì)胞毒性的測試,發(fā)現(xiàn)不同分子量的α殼聚糖免疫效果優(yōu)于β殼聚糖,殼聚糖硫酸酯和季銨鹽衍生物的免疫效果優(yōu)于低分子量的殼聚糖,而殼聚糖季銨鹽衍生物的免疫效果最佳;采用熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)及蛋白印跡等技術(shù),對三類樣品的免疫機(jī)制研究表明:100μg/mL的殼聚糖硫酸酯可以激活RAW 264.7細(xì)胞中的PI3K/Akt通路,并促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1進(jìn)入核內(nèi),從而增加TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。100μg/mL的殼寡糖可以激活RAW 264.7細(xì)胞中的MAPK及PI3K/Akt通路,并促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)入核內(nèi),從而增加IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)。而50μg/mL的殼聚糖季銨鹽即可激活RAW 264.7細(xì)胞中的MAPK,JAK/STAT和PI3K/Akt通路,并促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1進(jìn)入核內(nèi),從而增加IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)。2)新城疫是由新城疫病毒感染導(dǎo)致的一種禽類傳染病,自1926年首次發(fā)現(xiàn)以來給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失,因而受到了重視,目前主要通過接種疫苗預(yù)防該病。納米載藥系統(tǒng)能夠延長藥物釋放時間,達(dá)到緩釋效果,作為佐劑可以使抗原緩慢釋放從而具有降低抗原使用量等優(yōu)點(diǎn)。本研究以新城疫病毒為抗原,將殼聚糖季銨鹽和殼聚糖作為佐劑,采用離子交聯(lián)法制備了載新城疫病毒殼聚糖季銨鹽/殼聚糖納米粒,得到的納米粒平均粒徑為320±0.84 nm,多分散系數(shù)為0.36±0.02,zeta電位為+18.3±0.5 mV,包封率和載藥量分別為37.4±2.69%和16.16±1.84%。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)納米粒呈類球形,且表面光滑,無明顯聚集現(xiàn)象,且粒徑與粒度儀測定結(jié)果相近,進(jìn)一步證明了納米粒制備成功。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)證明納米粒無明顯細(xì)胞毒性,生物安全性好。使用載新城疫病毒納米粒免疫無特定病原體的雞后發(fā)現(xiàn),載新城疫病毒殼聚糖季銨鹽/殼聚糖納米粒組的體液免疫水平稍低于白油佐劑組,但其細(xì)胞免疫水平顯著優(yōu)于白油組,且均可以使雞對新城疫病毒的保護(hù)率達(dá)到100%。綜上所述,殼寡糖、殼聚糖硫酸酯及殼聚糖季銨鹽能夠激活RAW 264.7細(xì)胞的信號通路,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。殼聚糖季銨鹽/殼聚糖納米粒作為新城疫疫苗的佐劑能夠顯著增強(qiáng)雞的體液免疫和細(xì)胞免疫,保護(hù)免疫雞不被新城疫病毒感染,且為殼聚糖季銨鹽/殼聚糖納米粒用作新型疫苗佐劑的研制提供依據(jù)。
【圖文】：

概述Nanoparticle, NP）的直徑在 10-1000 nm 之間（Kumar et成分接近，因而可以通過內(nèi)吞作用高效地進(jìn)入活細(xì)胞。ahmoudElsabahyandWooley,2012）所示，納米粒具有比徑小等特點(diǎn)，因其特殊的物理和化學(xué)特性得以在許多醫(yī)藥因遞送、成像、光動力治療、組織工程（Vanic and Skal., 2013）。納米粒的粒徑小，，因而能夠透過多種生物屏標(biāo)組織。具有靶向性功能的納米�？赡芸朔退幮裕↘im11）。另外，基于納米結(jié)構(gòu)的診斷方法具有更高的分辨率統(tǒng)方法具有優(yōu)勢（Nam et al., 2003）.

ocytosis）作用內(nèi)化納米粒（Lunovet al.,2010）。納米粒的大�。�; Rejman et al., 2004）、形狀（Chithrani et al., 2006）、表面電荷abhasetwar et al., 1998）和表面化學(xué)（Labhasetwar et al., 1998;理化性質(zhì)對細(xì)胞提呈有很大的影響。如圖 1.2 所示（Lietal.機(jī)體后，可與溶解在體液中的細(xì)胞外生物分子（如蛋白質(zhì)、互作用，而后再與細(xì)胞膜發(fā)生作用（Treuel et al., 2013）。納白質(zhì)，即所謂的蛋白冠（Cedervall et al., 2007a; Cedervall et atal.,2012）。因此，細(xì)胞表面受體是與包裹在生物分子中的粒與粒子結(jié)合的。另外，細(xì)胞也可被動攝取納米粒（Treuelet al.Smith et al., 2013）所示，被攝取后的納米粒對免疫的激活可一是直接起到免疫刺激作用（如圖中 a 路徑），二是通過遞疫刺激作用（如圖中 b 路徑）。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S859.797

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本文編號：2611566