【摘要】：沙蔥螢葉甲Galeruca daurica(Joannis)是近年來在內(nèi)蒙古草原上猖獗成災的一種新害蟲,以成蟲滯育越夏,以卵滯育越冬。滯育在提高昆蟲生存能力方面扮演著重要角色,但目前對沙蔥螢葉甲滯育的機理還一無所知。本研究利用RNA-Seq技術對沙蔥螢葉甲成蟲滯育前期(pre-diapause)、滯育期(diapause)和滯育后期(post-diapause)3個階段進行了轉錄組測序,篩選了滯育相關基因,并對3個滯育相關基因的分子特性與表達譜進行了研究。同時,測定了成蟲滯育不同階段主要生理生化指標,以期揭示沙蔥螢葉甲成蟲夏滯育的分子機理,為進一步揭示其成災機制及綜合治理提供必要的基礎。主要研究結果如下:1.明確了沙蔥螢葉甲成蟲滯育不同階段主要生理生化指標的變化特點。在滯育前后水分和總蛋白含量較高,滯育期間含量較低,說明沙蔥螢葉甲成蟲滯育期間代謝活動較低;而脂肪和糖原含量的趨勢與之相反,說明脂肪和糖原是沙蔥螢葉甲成蟲滯育期間的主要能源物質(zhì)。海藻糖含量在滯育不同階段波動較大,海藻糖含量的高低與沙蔥螢葉甲在滯育不同階段的能量需求及轉換有密切關系。2.利用Illumina HiSeq2500測序平臺,組裝得到82,292個Unigenes。通過比對滯育前期-滯育期,共發(fā)現(xiàn)差異基因3,099個,主要富集于新陳代謝、碳水化合物代謝和脂肪代謝等分子功能類別;滯育期-滯育后期比對時,則發(fā)現(xiàn)81個差異基因,主要富集于脂肪生物合成、脂肪代謝調(diào)控和細胞脂肪代謝等分子功能類別。為了驗證RNA-Seq數(shù)據(jù),選取11個特異性表達基因進行qRT-PCR驗證。結果顯示,qRT-PCR和RNA-Seq結果表達趨勢一致。3.海藻糖酶(trehalase,Tre)作為昆蟲體內(nèi)海藻糖代謝的關鍵性酶,在昆蟲能量調(diào)節(jié)和生長發(fā)育中具有重要作用。通過RACE技術,克隆獲得1條沙蔥螢葉甲可溶性海藻糖酶(GdTre1)基因序列。該基因cDNA全長1,933 bp,其中ORF長1,704bp,共編碼567個氨基酸;蛋白預測分子量66.56 kD,等電點6.62;編碼蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能結構域,包含1條信號肽,不具有跨膜結構。同源序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析表明,GdTre1與馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata Tre1b的同源性最高,氨基酸序列一致性達70.25%。qRT-PCR檢測結果表明,GdTre1在沙蔥螢葉甲各發(fā)育階段均有表達,其中在卵期和成蟲滯育期間高表達,而在幼蟲、預蛹、蛹及成蟲滯育前低表達;在成蟲不同組織中,通常在腹部表達量最高,其次為胸部,最低為頭部;GdTre1表達量隨著溫度升高而上升,30℃達最高值,而后隨溫度升高略有下降。沙蔥螢葉甲不同日齡成蟲體內(nèi)GdTre1表達量及Tre活性均存在顯著差異,且GdTre1表達量與Tre活性變化趨勢一致。以上結果表明,海藻糖酶與沙蔥螢葉甲生長發(fā)育和成蟲夏滯育有密切關系,該結果為進一步揭示昆蟲夏滯育的分子機理提供了必要的基礎。4.熱激蛋白(heat shock poteins,Hsps)是一種生物體細胞在外界不利環(huán)境條件刺激下誘導產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)。Hsps被認為是與滯育關系最為密切的基因。通過RACE技術,克隆得到沙蔥螢葉甲熱激蛋白10基因(GdHsp10a)的cDNA序列。序列分析表明,GdHsp10a基因的cDNA全長為526 bp,其中ORF為333 bp,編碼110個氨基酸,預測蛋白分子量11.97 kD,等電點9.74;無信號肽,不含跨膜結構。多重序列比對及系統(tǒng)進化分析結果表明,GdHsp10a與光肩星天牛Anoplophora glabripennis親緣關系最近,氨基酸序列一致性為53.15%。qRT-PCR結果顯示,GdHsp10a基因在沙蔥螢葉甲各發(fā)育階段均有表達,其中在卵期和成蟲期的表達量顯著高于幼蟲期、預蛹期及蛹期;成蟲羽化第25 d時表達量最高,其次為100、10和7 d;溫度對GdHsp10a表達量有顯著影響,30℃條件下表達量最高,其次為35℃,15、20、25及40℃條件下表達量最低且無顯著差異。上述結果表明,GdHsp10a可能在沙蔥螢葉甲生長發(fā)育及成蟲夏滯育中起著多重作用,本研究為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。5.保幼激素(juvenile hormone,JH)在昆蟲滯育的調(diào)控中扮演著重要角色。保幼激素結合蛋白(juvenile hormone binding protein,JHBP)在JH的保護和運輸中具有重要作用。通過RACE技術,克隆得到沙蔥螢葉保幼激素結合蛋白(GdJHBP)基因的cDNA序列。cDNA全長826 bp,其中ORF為714 bp,共編碼237個氨基酸;蛋白質(zhì)預測分子量26.58 kD,等電點4.37;編碼蛋白具有JHBP超基因家族典型的功能結構域,發(fā)現(xiàn)1條信號肽,無跨膜區(qū)。同源序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明,GdJHBP與同為鞘翅目的馬鈴薯甲蟲JHBP 3p2親緣關系最近,氨基酸序列一致性為30%。qRT-PCR檢測結果表明,GdJHBP在沙蔥螢葉甲卵期、蛹期低表達,而在幼蟲期及成蟲期高表達;在成蟲不同組織中,在腹部和胸部表達量最高,其次是頭部;溫度顯著影響GdJHBP基因的表達,35℃時表達量最高,而后下降。以上結果表明,GdJHBP蛋白在沙蔥螢葉甲的生長發(fā)育和夏滯育中發(fā)揮著重要作用,該結果為進一步揭示昆蟲夏滯育的分子機理提供了必要的基礎。
【圖文】：

內(nèi)基因的動態(tài)轉錄水平，細胞內(nèi)稀有、正常轉錄本也可被鑒定和定量，還品中某些特異的轉錄本序列結構信息。利用 Ploy（A）結構提取待測樣，隨機打斷后，經(jīng)反轉錄為 cDNA 后進行測序（圖 1）。如測序物種已有基 RNA-Seq 結果與基因組序列信息比對分析，來獲取基因表達、可變剪切優(yōu)化等結果，還可發(fā)現(xiàn)新基因；但是對于沒有基因組的物種，則可通過從novo）的方法進行轉錄組測序，即對測序所得的片段進行從頭組裝，從種的基因序列集（unigenes）數(shù)據(jù)[199]，基于此序列信息，可以進行后續(xù)的分析，包括基因結構注釋、基因表達量分析和基因功能注釋等，為生物學因序列信息，為后續(xù)分子水平的研究奠定基礎。第二代測序技術，又稱新一代測序技術(next-generation sequencing tech)，因其有別于第一代測序技術的 Sanger 測序法而得名。相較于傳統(tǒng)的 Sa術，第二代測序技術除了能夠出色地完成常規(guī)測序，還能夠應用于常規(guī)測的領域。目前，推出的測序平臺有 454、Illumina、Solid 以及 Ion Torrent。

B：脂肪含量2.3.2 沙蔥螢葉甲成蟲不同滯育階段的總糖、海藻糖及糖原含量從圖4可知，總糖含量在滯育期極顯著低于滯育前和滯育后（F=15.22，P<0.001），而糖原含量正好相反，并且總糖和糖原含量在滯育期間（羽化后 7～60 d）無顯著差異（P＜0.05）。海藻糖含量在沙蔥螢葉甲成蟲滯育不同階段變化較大，滯育前期（羽化后 3 d）海藻糖含量高達 23.75 μg/mg，，急劇下降至羽化后（7 d 和 10 d）的 11.12 μg/mg和 11.58 μg/mg，5 d 后又恢復至滯育前期的水平
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S812.6

【參考文獻】

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本文編號：2611269