【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的病原體之一,每年給全球養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,至今無(wú)有效的藥物。2006年,我國(guó)爆發(fā)了高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV),其毒力增強(qiáng)與RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp,nsp9)和解旋酶(Helicase,nsp10)的變異有關(guān),但具體的分子機(jī)制尚不清楚。此外nsp9與nsp10是PRRSV復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(RTC)最重要的組成部分,但其參與復(fù)制的分子機(jī)制仍未闡明。本研究通過晶體學(xué)方法解析了動(dòng)脈炎病毒科PRRSV解旋酶的首個(gè)全長(zhǎng)結(jié)構(gòu),揭示了一種1B結(jié)構(gòu)域走向不同的全新構(gòu)象,并首次展示了C末端結(jié)構(gòu)域的三維構(gòu)象。進(jìn)一步通過生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了1B結(jié)構(gòu)域在解旋酶與核酸底物結(jié)合過程中發(fā)揮著重要的作用,及C末端結(jié)構(gòu)域?qū)TPase活性具有重要影響。本研究為闡釋nsp10參與病毒復(fù)制的分子機(jī)制及藥物設(shè)計(jì)提供了新思路。具體工作內(nèi)容如下:1.PRRSV nsp10結(jié)構(gòu)解析。原核表達(dá)純化PRRSV nsp10可溶性蛋白,通過晶體初篩及優(yōu)化獲得了高分辨率的晶體,并利用X-Ray衍射收集收據(jù)并解析了分辨率為3.0?的晶體結(jié)構(gòu)。PRRSV nsp10是由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的單體:N端鋅指結(jié)構(gòu)域(ZBD)、非特征性1B結(jié)構(gòu)域及C端解旋酶核心結(jié)構(gòu)域。我們發(fā)現(xiàn)PRRSV nsp10 1B結(jié)構(gòu)域走向與其他解旋酶不同,將其與已有結(jié)構(gòu)的SF1家族解旋酶進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)1B極具柔性且其在序列和結(jié)構(gòu)上的位置也有較大的變動(dòng),它并非是解旋酶必須存在的結(jié)構(gòu)域。我們從結(jié)構(gòu)上揭示了PRRSV nsp10 1B結(jié)構(gòu)域走向不同的原因在于1B上第126位亮氨酸(L)和第128位蘇氨酸(T)分別與ZBD上第19位丙氨酸(A)和第20位半胱氨酸(C)及1A結(jié)構(gòu)上第129位半胱氨酸(C)形成了氫鍵作用力。另外本文首次展示了動(dòng)脈炎病毒科解旋酶C末端結(jié)構(gòu)域是由三個(gè)β-sheet和兩個(gè)相互垂直的α-helix組成,該規(guī)整性結(jié)構(gòu)提示了該區(qū)域在行使功能過程中可能發(fā)揮著重要作用。2.PRRSV nsp10 1B結(jié)構(gòu)域與C末端結(jié)構(gòu)域的功能研究。為了研究1B結(jié)構(gòu)域與C末端結(jié)構(gòu)域與功能的關(guān)系,我們構(gòu)建了nsp10Δ1B、nsp10 1-389重組質(zhì)粒,并純化了相應(yīng)可溶性蛋白。首先利用EMSA方法檢測(cè)了nsp10Δ1B蛋白與dsDNA和dsRNA的結(jié)合力,結(jié)果表明nsp10Δ1B與dsDNA結(jié)合力相比于野生型蛋白降低了約50%;ATPase活性雖有所減弱但不會(huì)完全喪失;Helicase活性檢測(cè)結(jié)果表明1B缺失蛋白與野生型蛋白不存在顯著性差異,揭示了1B結(jié)構(gòu)域主要功能是與核酸底物的結(jié)合。同樣,為了研究nsp10 C末端結(jié)構(gòu)域與功能的關(guān)系,我們檢測(cè)nsp10 1-389蛋白的ATPase和Helicase活性,結(jié)果表明C末端結(jié)構(gòu)域的缺失完全喪失了ATPase的活性,但解旋功能幾乎不受影響。說明PRRSV nsp10 C末端結(jié)構(gòu)是ATPase活性發(fā)揮的必要組件。
【圖文】：

2圖 1.1 解旋酶的分類(Singleton et al 2007)Fig 1.1 The classification of Helicase認(rèn)識(shí) SF1、SF2 家族解旋酶，研究學(xué)者基于序列分1 家族解旋酶細(xì)分為三個(gè)家族 UvrD/Rep、Pif1-like 和九個(gè)家族 RecG-like、RecQ-like、Rad3/XPD、Ski2、DEAD-box、DEAH/RHA 和一個(gè)亞組 NS3/NPH-Ⅱ旋酶最經(jīng)典的解旋酶是真核生物解旋酶 Upf1，這類解旋：其一是 N 端具有非常保守的特征性結(jié)構(gòu)域：半胱），即鋅指結(jié)構(gòu)域（ZBD）。該區(qū)域不僅影響 ATPase2 的結(jié)合(Kadlec et al 2006, Chamieh et al 2008)。真核

豬繁殖與呼吸綜合征病毒解旋酶的結(jié)構(gòu)解析及功能研究管途徑可以快速檢測(cè)并降解含有 PTC 的 mRNA，，即無(wú)義 mRNA 降解途D 通路）(Isken and Maquat 2007)。在釀酒酵母和秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn) NMD心成分是 Upf1、Upf2 和 Upf3(Leeds et al 1992, Page et al 1999)，且 NMD 過步都需要 Upf1 解旋酶的參與（圖 1.3）。另一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域是 C 端的 RecA-，這個(gè)結(jié)構(gòu)域包含了由 Walker Amotif 形成的磷酸鹽結(jié)合 loop（P-loop）以r B motif 形成參與 ATP 水解的精氨酸手指域(Gorbalenya and Koonin 1manya et al 1996, Korolev et al 1997)。除了這兩大保守的核心結(jié)構(gòu)外，Upf一般也包含輔助催化活性及與其他蛋白相互作用的其他配件結(jié)構(gòu)eton and Wigley 2002, Singleton and Dillingham 2007)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：2611104