【摘要】：奶牛健康養(yǎng)殖是中國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的前提。傳統(tǒng)奶牛養(yǎng)殖業(yè)中,不規(guī)范的飼養(yǎng)管理方式使養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化,導(dǎo)致奶牛乳腺炎發(fā)生率不斷升高。奶牛乳腺炎是影響奶牛健康養(yǎng)殖的主要疾病,不僅給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還威脅到食品安全和人類健康。為了治療奶牛乳腺炎,多種抗生素被開發(fā),并成為目前治療奶牛乳腺炎的主要手段。但是,由于在實(shí)際畜牧生產(chǎn)過程中大量且不合理使用抗生素,導(dǎo)致對抗生素具有多重耐藥性的菌株不斷出現(xiàn),使奶牛乳腺炎治愈率越來越低。因此,研究奶牛健康養(yǎng)殖,需要研究引起奶牛乳腺炎病原菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)理。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一,其致病性強(qiáng),且具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和抗生素耐受性。本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),通過對金黃色葡萄球菌野生型菌株BA01611和苯唑西林處理BA01611的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)3個(gè)表達(dá)量差異顯著的轉(zhuǎn)錄因子SarS、SarV和VraR。本研究首先通過qRT-PCR驗(yàn)證與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的一致性;然后,利用基因敲除的方法探究SarS、SarV和VraR對金黃色葡萄球菌表型的影響;最后,本論文還試圖找到vraR調(diào)控的下游基因。主要結(jié)果如下:1.qRT-PCR與測序結(jié)果的一致性檢驗(yàn)。分析qRT-PCR的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),與野生菌相比,經(jīng)苯唑西林處理后,sarS、sarV和vraR的表達(dá)量分別為野生菌株表達(dá)量的0.56、0.79、15.45倍,與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。2.目的基因敲除菌和過表達(dá)菌株的構(gòu)建。本試驗(yàn)利用同源重組的方法,利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌穿梭載體pKZ2,成功構(gòu)建了sarS、sarV和vraR基因敲除菌BA01611-ΔsarS、BA01611-ΔsarV和BA01611-ΔvraR;以質(zhì)粒pSE1為基本骨架,成功構(gòu)建vraR的過表達(dá)菌株。3.SarS與金黃色葡萄球菌對苯唑西林、萬古霉素、替考拉寧的抗性均無關(guān),而SarV、VraR能夠提高金黃色葡萄球菌對苯唑西林和替考拉寧的抗性。SarS抑制金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力,而SarV、VraR與金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力無關(guān)。Sar S、SarV和VraR都能減弱金黃色葡萄球菌的溶血能力,對金葡菌凝固血漿的作用均不明顯。4.探究了vraR調(diào)控的下游基因。通過對實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn),甲氧西林抗性基因mecA在BA01611(WT)、BA01611-ΔvraR和BA01611-ΔvraR-complement三株菌中的表達(dá)量無顯著差異,表明vraR并不參與mecA的表達(dá)調(diào)控。進(jìn)一步分析qRT-PCR的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),8個(gè)基因在mRNA水平的表達(dá)量受vraR的調(diào)控,這8個(gè)基因?yàn)?vraX、vraC、vraS、msrR、murA2、mgt、SAOUHSC_01761和SAOUHSC_02101。綜上所述,本研究利用基因敲除手段,成功構(gòu)建了sarS、sarV、vraR基因敲除菌,并在此基礎(chǔ)上探究了SarS、SarV和VraR對金黃色葡萄球菌表型的影響。此外,還通過qRT-PCR的方法找到8個(gè)vraR調(diào)控的下游基因,并對這些基因的功能做出分析,為探究金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2607901