發(fā)布時間：2020-03-30 15:32

【摘要】：氟在土壤、空氣、巖石和水中廣泛存在,是機體所必需的微量元素之一。同時,氟也常被應(yīng)用到醫(yī)藥、口腔護理產(chǎn)品以及諸如化肥、鋼鐵、鋁、陶瓷等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中。適量的攝入氟有益于牙釉質(zhì)的形成和骨骼的礦化,而過量的攝入氟則會造成機體骨相和非骨相組織的嚴重損害。腎臟是機體內(nèi)氟的主要蓄積和排泄器官,對氟的毒性非常敏感。研究顯示,過量的攝入氟可誘導(dǎo)腎臟發(fā)生病理組織學(xué)變化、細胞凋亡和細胞周期阻滯等一系列的損傷。然而,氟誘導(dǎo)腎臟損傷的分子作用機理目前還尚不清楚。因此,本研究以ICR小鼠為研究對象,運用實驗病理學(xué)、流式細胞術(shù)、qRT-PCR、Western blotting、ELISA和TUNEL等研究方法,以腎臟結(jié)構(gòu)、功能、抗氧化能力、細胞周期、凋亡、自噬、炎癥反應(yīng)和PI3K-Akt信號通路中相關(guān)因子的蛋白及基因表達的觀測為目標(biāo),從組織、細胞和分子水平探討氟化鈉(NaF)對小鼠腎臟的毒性作用及其可能的分子作用機理,以填補氟在這些方面的研究空白,并為進一步研究氟對腎臟的毒性效應(yīng)提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:1.NaF對小鼠腎臟結(jié)構(gòu)、功能和抗氧化能力的影響本試驗選用240只(雌雄各半)4周齡健康ICR小鼠,隨機均分為4個組,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,然后經(jīng)灌胃途徑給予小鼠不同劑量的NaF(0、12、24和48 mg/kg),灌胃量為1mL/100g,試驗期為42天。試驗期間,每天對小鼠進行臨床觀察。試驗第21和42天對小鼠腎臟進行病理學(xué)觀察。結(jié)果表明,NaF的劑量達到12 mg/kg及以上時可引起腎臟出現(xiàn)不同程度的體積縮小、臟器指數(shù)降低、腎小管上皮細胞變性或/和壞死、炎性細胞浸潤、腎小管透明管型形成以及腎小球腫大,腎臟組織結(jié)構(gòu)受損。上述病變呈現(xiàn)明顯的時間和劑量依賴性。試驗第21和42天,運用生物化學(xué)法檢測小鼠腎臟功能指標(biāo)。結(jié)果表明,NaF的劑量達到12 mg/kg及以上時可提高血清Cr、UA、BUN的含量以及腎臟LDH的活性和尿液NAG的活性,降低腎臟Na+/K+-ATPase和ACP活性,腎臟功能受損。試驗第21和42天,運用生物化學(xué)和qRT-PCR法檢測小鼠腎臟氧化損傷指標(biāo)、非酶性和酶性抗氧化指標(biāo)。結(jié)果表明,NaF的劑量達到12 mg/kg及以上時顯著提高ROS的產(chǎn)生水平以及MDA、PC和8-OHdG的含量,降低ASA和AHR的能力、GSH的含量以及抗氧化酶(SOD、CAT、GR和GSH-Px)的活性,抗氧化酶活性的降低與抗氧化酶(CuZn-SOD、CAT、GR和GSH-Px)基因表達水平的降低密切相關(guān),腎臟發(fā)生氧化損傷,最終導(dǎo)致腎臟的結(jié)構(gòu)和功能受損。氧化損傷是NaF誘導(dǎo)腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的作用機理之一。2.NaF對小鼠腎臟細胞周期的影響試驗動物的分組及管理與1同。機體內(nèi)過量的ROS可攻擊DNA等生物大分子物質(zhì),造成DNA的損傷,進而引起細胞周期進程的改變。試驗第21和42天對小鼠腎臟細胞周期以及周期相關(guān)調(diào)控分子的mRNA和蛋白表達水平進行了測定。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,腎臟發(fā)生了G2/M期細胞周期阻滯。Western blotting和qRT-PCR的檢測發(fā)現(xiàn)p21、Gadd45a、p53的mRNA表達水平以及p-p53、p-CDK1(Tyr15)、p21、Gadd45a的蛋白表達水平增加,PCNA、CyclinB1、CDK1、PI3K、Akt、mdm2的mRNA表達水平和PCNA、CyclinB1、mdm2、PI3K、p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)的蛋白表達水平降低。結(jié)果表明,NaF的劑量達到12 mg/kg及以上時可通過抑制PI3K-Akt-p53信號通路誘導(dǎo)小鼠腎臟發(fā)生G2/M期細胞周期阻滯,導(dǎo)致腎臟細胞的增殖和腎臟的生長發(fā)育受阻。3.NaF對小鼠腎臟細胞凋亡和自噬的影響試驗動物的分組及管理與1同。細胞周期檢測點在檢測到細胞DNA受損之后,會將細胞阻滯于某一特定時期內(nèi),對其損傷進行修復(fù),若修復(fù)無效則會誘導(dǎo)其死亡(如凋亡、自噬等)。試驗第21和42天對小鼠腎臟細胞凋亡和自噬以及凋亡和自噬相關(guān)調(diào)控分子的mRNA和蛋白表達水平進行了檢測。流式細胞術(shù)和TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟細胞的凋亡率明顯增加。qRT-PCR和Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)Foxo3a、Bim、Bax、caspase 9、caspase 3、Bad、Becline1、LC3(自噬標(biāo)志物)的mRNA表達水平,Foxo3a、Bim、Bax、C-caspase 9、C-caspase 3、Bad、Becline1的蛋白表達水平以及LC3-II/LC3-I的值明顯升高,Bcl-2、Bcl-xL、mTOR、p70s6k、p62的mRNA表達水平以及Bcl-2、Bcl-xL、mTOR、p-p70s6k、p62的蛋白表達水平明顯降低。結(jié)果表明,NaF的劑量達到12 mg/kg及以上時可通過抑制PI3K-Akt-Foxo3a/caspase9/Bad/mTOR信號通路誘導(dǎo)小鼠腎臟細胞發(fā)生凋亡和自噬。4.NaF對小鼠腎臟細胞炎癥反應(yīng)的影響試驗動物的分組及管理與1同。試驗第21和42天,運用生物化學(xué)、ELISA、qRT-PCR和Western blotting法測定小鼠腎臟NO和PGE_2的含量、iNOS的活性以及炎性相關(guān)因子的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果表明,NaF的劑量達到12 mg/kg及以上時可提高NO和PGE_2的含量、iNOS的活性和mRNA表達水平以及COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA和蛋白表達水平,降低了IL-4和IL-10的mRNA和蛋白表達水平,腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng),與病理組織學(xué)的觀察結(jié)果一致。PI3K-Akt-NF-κB信號通路的抑制以及炎性細胞因子表達的改變是NaF誘導(dǎo)腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)的分子調(diào)控機理。綜上所述,NaF的劑量達到12 mg/kg及以上時可誘導(dǎo)腎臟發(fā)生氧化損傷、G2/M期細胞周期阻滯、細胞凋亡、自噬以及炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致腎臟的結(jié)構(gòu)和功能受損。氧化損傷是NaF誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷的病理基礎(chǔ),G2/M期細胞周期阻滯、細胞凋亡、自噬以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生是NaF誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷的途徑,PI3K-Akt信號通路則是NaF誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷的分子調(diào)控機理。同時,本文首次系統(tǒng)地研究了NaF對小鼠腎臟結(jié)構(gòu)、功能和抗氧化能力的影響;首次從細胞水平、基因水平和蛋白水平上研究了NaF對小鼠腎臟細胞周期、凋亡、自噬和炎癥反應(yīng)的影響;首次探討了PI3K-Akt信號通路在NaF致小鼠腎臟損傷中的作用及其與腎臟細胞周期阻滯、凋亡、自噬和炎癥反應(yīng)之間的相互作用關(guān)系。
【圖文】：

圖 1-1 細胞周期示意圖[59]Fig. 1-1 Schematic of cell cycleBai 等[60]在采用流式細胞術(shù)研究高氟日糧對雛雞腎臟細胞周期的影響時發(fā)現(xiàn)，雛雞腎臟 G0/G1 期的細胞數(shù)量隨著日糧中氟含量的升高而呈現(xiàn)明顯增加的趨勢，表明高氟誘導(dǎo)了腎臟 G0/G1 期的細胞周期阻滯。Chen 等[61]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飲水中氟化鈉的含量為50 mg/L 時會擾亂大鼠腎臟 G1/S 期和 G2/M 期的細胞周期進程，進而影響大鼠腎臟細胞的增殖。還有報道顯示，當(dāng)飲水中氟化鈉的含量為 50 mg/L 時會明顯降低大鼠腎臟 G2/M期的細胞數(shù)量[54]。這些研究結(jié)果均表明，過量的氟可引起腎臟細胞周期的阻滯，然而具體將腎臟細胞阻滯在哪個時期目前還尚無定論，仍需進一步的研究。與此同時，有關(guān)氟誘導(dǎo)腎臟細胞周期阻滯的機理也尚未見有報道，還需探索。2.2.3 氟與腎臟細胞凋亡

們在本論文中將其稱為 Akt。Akt 蛋白家族在結(jié)構(gòu)上均包含位于 N 端的血小板同源結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homolgydomain，PH)、位于 C 端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域和位于中間的激酶催化結(jié)構(gòu)域[101]（圖 1-2）。Akt的血小板同源結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo) Akt 與 PIP3 之間的結(jié)合。Akt 的激酶催化結(jié)構(gòu)域與 PKA和 PKC 的激酶結(jié)構(gòu)域具有高度的相似性，在這個結(jié)構(gòu)域當(dāng)中存在一個蘇氨酸殘基(Thr308)，，該位點的磷酸化是 Akt 活化所必需的。在 Akt 的調(diào)控結(jié)構(gòu)域中存在一個絲氨酸殘基(Ser473)，Ser473 位點的磷酸化可使 Akt 獲得更高的活性[102]。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S859.8

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本文編號：2607727