【摘要】：細胞重編程技術(shù)可以將已經(jīng)分化的體細胞重新誘導(dǎo)成多能性干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSC),重新賦予分化任何細胞的潛力,這對瀕危鳥類或珍稀家禽種子資源保護與利用具有重要的價值。本研究以雞為模型,構(gòu)建一個標(biāo)記雞內(nèi)源PouV基因的熒光報告系統(tǒng),以便追蹤體細胞重編程過程。從而探索體細胞重編程為iPSC的條件和機制。首先,本研究利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9),將紅色熒光mCherry通過同源臂介導(dǎo)的末端連接(Homology-Mediated End Joining,HMEJ)方式定點插入雞內(nèi)源PouV基因最后一個外顯子的終止密碼子處,從而示蹤雞內(nèi)源PouV基因表達情況。結(jié)果顯示:成功構(gòu)建了雞內(nèi)源性PouV啟動子驅(qū)動mCherry基因的pPouV-mCherry表達載體,并將該載體轉(zhuǎn)染雞體細胞,成功篩選出pPouV-mCherry雞體細胞系。為雞體細胞誘導(dǎo)重編程建立了一個標(biāo)記內(nèi)源PouV基因的熒光報告示蹤體系。而后,我們利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子作為載體將雞源3個多能轉(zhuǎn)錄因子Nanog、PouV、Lin28(NPL)轉(zhuǎn)入pPouV-mCherry雞體細胞中進行誘導(dǎo),來探索雞體細胞誘導(dǎo)iPSC的條件和機理。試驗成功構(gòu)建了攜有雞源的3個多能基因Nanog、PouV和Lin28(NPL)的過表達載體PB-NPL-eGFP,并將該過表達載體轉(zhuǎn)染pPouV-mCherry雞體細胞中進行誘導(dǎo)。結(jié)果顯示:標(biāo)記pPouV-mCherry雞胚成纖維細胞和雞胚心肌細胞在誘導(dǎo)過程中細胞都出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,而pPouV-mCherry DF-1在誘導(dǎo)第7天時,細胞開始變紅;誘導(dǎo)第30天,紅色克隆逐漸變大,與飼養(yǎng)層分界明顯具有一定的立體感,細胞形態(tài)類似于iPSC。經(jīng)手工傳代后,誘導(dǎo)第35天,紅色克隆細胞開始凋亡,紅光也逐漸消失。將誘導(dǎo)第30天紅色克隆進行堿性磷酸酶染色和多能基因表達分析鑒定,結(jié)果顯示:紅色細胞克隆表現(xiàn)堿性磷酸酶陽性,5個多能轉(zhuǎn)錄因子Nanog、PouV、Lin28、c-Myc和Klf4與體細胞相比都顯著上調(diào),家禽干細胞相關(guān)的多能基因TBX3、TFCP2L1、ENS-1和c-Kit與體細胞相比也都顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明了內(nèi)源PouV標(biāo)記的熒光報告載體可以示蹤體細胞重編程,誘導(dǎo)獲得的紅色細胞克隆具有多能細胞特性。綜上所述,本試驗建立了雞內(nèi)源PouV標(biāo)記的體細胞誘導(dǎo)重編程的追蹤體系,并利用該追蹤體系,成功將pPouV-mCherry DF-1誘導(dǎo)成具有多能特性的細胞克隆。本研究為進一步開展家禽體細胞重編程研究揭示家禽體細胞重編程的條件和機理奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

論文邐ＰｏｕＶ基因標(biāo)ｉ己雞體細胞誘導(dǎo)重編程的研究進展逡逑程對于生物體內(nèi)來說，是一個非常重要而且復(fù)雜的過程。細胞從分化，，變成機體內(nèi)各組織器官。細胞的特性也從剛開始的全能性細胞，再分化變成前體細胞，最終分化為成體細胞，每一階段細態(tài)。上世紀(jì)５０年代以來，由英國著名胚胎學(xué)家Ｃ．Ｈ．Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎｇｔｏｎ景觀模型來解釋細胞發(fā)育過程，他把細胞發(fā)育看作小球從一至下方的過程，小球位置越高細胞發(fā)育能力越強（圖１－１）。Ｗａｄｄｉｎｇｔ”模型反映了細胞發(fā)育總是從潛力高的細胞類型分化成潛力低的■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■

廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文邐ＰｏｕＶ基因標(biāo)記雞體細胞誘導(dǎo)重編程的研究逡逑ＤＳＢ），在自然界生命體中，一般細胞機體會有兩種ＤＮＡ修復(fù)方法：第一種是同源同逡逑組（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，邋ＨＲ）的修復(fù)方式，第二種是非同源末端連接（Ｎｏｎ－逡逑ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＥｎｄ】ｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）修復(fù)方式（圖１－２）。通過這兩種修復(fù)方式使得ＤＮＡ在逡逑斷裂后能自然的進行修復(fù)連接［５６］。逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S831

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 葉于富;沈淼達;周琳;;新型豬誘導(dǎo)多潛能干細胞的成功培育[J];中華移植雜志(電子版);2009年03期

本文編號：2607108