【摘要】：異種器官移植是解決供體器官短缺的有效途徑,豬(Sus scrofa)由于器官大小、生理解剖結(jié)構(gòu)與人相近、繁殖率高、飼養(yǎng)成本低等優(yōu)勢,被認(rèn)為是理想的異種器官移植供體。豬器官移植到人體內(nèi)將會引起超急性免疫排斥反應(yīng)(hyperacute rejection,HAR),敲除豬的α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)可以避免HAR。然而豬的細(xì)胞表面仍存在多種非半乳糖抗原,它們在豬內(nèi)皮細(xì)胞及多種器官中均有所表達(dá),能夠在異種器官移植中引起諸如抗體沉積、補(bǔ)體激活等抗體介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng),其中包括N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和豬的Sd~a血型抗原。N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)是由單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)催化生成的一種唾液酸。豬的Sd~a血型抗原是由豬的一種糖基轉(zhuǎn)移酶即β1,4N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)催化合成的,人類和大多數(shù)非靈長類動物都會產(chǎn)生與Sd~a血型抗原結(jié)合的抗體。本研究在α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除(GGTA1knockout,GTKO)豬的基礎(chǔ)上利用CRISPR/Cas9和體細(xì)胞核移植技術(shù)制備CMAH基因敲除(CMAH~(-/-))巴馬小型豬和β4GalNT2基因敲除(β4GalNT2~(-/-))巴馬小型豬,并評估了CMAH~(-/-)巴馬小型豬的健康及繁育狀況。1.以GTKO豬為基礎(chǔ),針對豬CMAH基因設(shè)計sgRNA并構(gòu)建sgRNA/Cas9表達(dá)載體并進(jìn)行活性驗證,篩選敲除效率較高的CMAH-g1,采用電轉(zhuǎn)染的方式將載體轉(zhuǎn)入巴馬豬耳成纖維細(xì)胞BMEF(Bama minipigs Ear Fibroblast),鑒定為陽性的細(xì)胞作為核供體,利用體細(xì)胞核移植技術(shù)(Somatic Cell Nuclear Transfer Technique,SCNT)制備CMAH~(-/-)豬。提取仔豬基因組進(jìn)行PCR,鑒定仔豬突變類型;用Anti-Neu5Gc抗體進(jìn)行免疫熒光檢測確定仔豬器官Neu5Gc表達(dá)情況。采集CMAH~(-/-)巴馬豬血液檢測其生理指標(biāo);CMAH~(-/-)巴馬公豬性成熟后配種,以母豬的產(chǎn)仔數(shù)評價CMAH~(-/-)公豬的繁育能力。結(jié)果成功獲得了-2bp/-2bp和-1bp/-1bp共2種純合敲除類型的CMAH~(-/-)巴馬豬。免疫熒光檢測結(jié)果顯示在CMAH~(-/-)豬的胰腺、主動脈表面未檢到Neu5Gc表達(dá)。與野生豬(WT)相比,CMAH~(-/-)豬血常規(guī)和血生化指標(biāo)正常,CMAH~(-/-)公豬的生產(chǎn)力正常。2.以GTKO豬為基礎(chǔ),針對豬β4GalNT2基因第三外顯子設(shè)計sgRNA導(dǎo)向序列引物,構(gòu)建sgRNA/Cas9表達(dá)載體并進(jìn)行活性驗證,敲除效率高的載體電轉(zhuǎn)染BMEF。采用PCR、TA克隆及測序的方法鑒定單細(xì)胞克隆的突變類型,選擇陽性克隆點作為核供體,利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備β4GalNT2~(-/-)豬。分離仔豬外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的雙花扁豆凝集素(Fluorescein isothiocyanate conjugated Dolichos biflorus agglutinin,FITC-DBA)共孵育,檢測仔豬β4GalNT2的表達(dá)。本次使用敲除效率最高的bGal-g5制備敲除豬。經(jīng)過鑒定,成功獲得了基因型為+1bp/-3bp/-17bp的β4GalNT2基因敲除豬。細(xì)胞及仔豬鑒定結(jié)果均顯示其有三種敲除類型,說明豬β4GalNT2基因是多拷貝基因。仔豬PBMC與FITC-DBA共孵育后沒有綠色熒光,說明仔豬β4GalNT2基因已失活。3.采集WT巴馬豬、GGTA1基因敲除(GTKO)巴馬豬、CMAH~(-/-)巴馬豬、β4GalNT2~(-/-)巴馬豬的血液并分離其PBMC,與滅活的混合AB型人血清及猴血清共孵育,通過流式檢測豬PBMC與人、猴血清中抗體的結(jié)合情況。結(jié)果顯示,敲除GGTA1基因能夠有效地降低與豬PBMC結(jié)合的抗體量,在敲除GGTA1基因的基礎(chǔ)上敲除豬的CMAH基因或β4GalNT2基因,都能夠在原基礎(chǔ)上繼續(xù)降低抗體的結(jié)合量。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功制備了GGTA1/CMAH基因敲除豬和GGTA1/β4GalNT2基因敲除豬,GGTA1/CMAH基因敲除豬的健康狀況和繁育能力正常�？乖贵w反應(yīng)結(jié)果表明,敲除豬的CMAH基因和β4GalNT2基因能夠降低人、猴血清中的抗體結(jié)合含量,本次獲得的兩種基因敲除豬可為進(jìn)一步降低異種器官移植急性排斥反應(yīng)提供基礎(chǔ)研究材料。
【圖文】：

圖 1-1 異種移植是一種潛在的治療方法(Ekser et al., 2012)Fig.1-1 Disorders for which xenotransplantation is a potential therapy(Ekser et al., 2012)1.1.2 免疫排斥種類1.1.3.1 超急性排斥反應(yīng)(Hyperacute rejection，HAR)經(jīng)過科學(xué)家們多年研究的發(fā)現(xiàn)，將異源的器官移植到人或者非靈長動物體內(nèi)，4

現(xiàn)階段臨床使用的治療患者糖尿病的胰島素均來自豬，說明使用豬胰島對進(jìn)行治療是安全有效的。Windt 等人在 2009 年將表達(dá) hCD46 的豬胰島細(xì)胞移植到糖尿病的食蟹猴體內(nèi)并在移植后使用免疫抑制劑，在不注射胰島素的情況下，移植作用時間超過了一年(Windt et al., 2009)。將經(jīng)藻酸鹽膠囊化的豬胰島細(xì)胞移植到糖非靈長類動物皮下后，胰島細(xì)胞可維持功能近 6 個月(Dufrane et al., 2010)。.1.5.2 心臟移植Kuwaki 和 Shimizu 等人分別在 2005 年和 2008 年發(fā)表了文章，文章表明，兩個研隊將敲除了 GGTA1 基因的豬心臟采用異位移植的方式植入狒狒的體內(nèi)，最長可維能 6 個月的時間(Kuwakietal.,2005；Shimizuetal.,2008)。此后，，在 2012 年，Mohiud在團(tuán)隊將敲除 GGTA1 同時轉(zhuǎn)入人 CD46 基因的豬心臟進(jìn)行移植，移植后器官受體時間長達(dá) 236 天(Mohiuddin et al., 2012)。除此之外，異種移植在肝臟、腎臟、小腸、肺移植等方面均已經(jīng)進(jìn)行了大量工取得了一定進(jìn)展(圖 1-2)。盡管在異種移植領(lǐng)域需要克服的困難還有很多，但隨著異官在受體體內(nèi)維持功能的時間不斷延長和諸多科研人員在異種移植研究中的通力，相信這一難題很快會被解決。異種器官移植解決人類器官短缺的難題指日可待。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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1 夏國偉;異種移植研究進(jìn)展[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2001年03期

本文編號：2606833