發(fā)布時間：2020-03-29 17:35

【摘要】：本研究首先研究飼糧汞污染(以氯化汞的形式添加)對蛋雞生產(chǎn)性能,蛋品質(zhì),主要組織器官損傷,卵泡閉鎖率和血清激素水平的影響,同時探討飼糧汞污染對蛋雞肝臟、腎臟和卵巢抗氧化系統(tǒng)的影響以及研究其相關(guān)分子機制。在體內(nèi)試驗基礎(chǔ)上,體外分別構(gòu)建蛋雞卵巢顆粒細胞模型和雞胚腎細胞模型,進一步研究氯化汞處理對蛋雞孕酮激素分泌的影響分子機制和氯化汞誘導雞胚腎細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)PERK-ATF4-CHOP信號通路參與的細胞凋亡分子機制。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1飼糧汞污染對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響本試驗旨在研究飼糧汞污染對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響。選取健康且體重相近的40周齡海蘭褐蛋雞768只,隨機分成4個處理組,每組8個重復,每個重復24只雞。4個處理組飼糧中汞含量分別為0.28,3.33,9.42,27.24 mg/kg。試驗周期為10周,包括1周預飼期和9周正式期。結(jié)果表明,飼糧汞污染可以顯著降低蛋雞產(chǎn)蛋率(P0.05)和平均蛋重(P0.05),反而顯著提高料蛋比(P0.05),同時對蛋雞平均采食量和死淘率無顯著影響(P0.05)。飼糧汞污染還可以顯著降低哈氏單位(P0.05),蛋白高度(P0.05),蛋殼強度(P0.05)和蛋殼厚度(P0.05),而對蛋黃顏色無顯著影響(P0.05)。另外,3.33,9.42和27.24mg/kg汞處理組的蛋黃、蛋白、蛋殼和全蛋中汞沉積量均顯著高于0.28 mg/kg汞處理組(P0.05)。哈氏單位(P0.05)和蛋白高度(P0.01)與蛋白、蛋黃和全蛋中汞沉積量均呈顯著性負相關(guān)關(guān)系。蛋殼強度(P0.05)和蛋殼厚度(P0.05)與蛋殼和全蛋中汞沉積量亦均呈顯著性負相關(guān)關(guān)系。2飼糧汞污染對蛋雞肝臟、腎臟損傷和卵泡閉鎖率的影響本試驗旨在研究飼糧汞污染對蛋雞肝臟和腎臟器官損傷,以及對卵泡閉鎖率的影響。結(jié)果表明,飼糧汞污染會造成汞在蛋雞心臟、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、卵巢、肌胃和腺胃內(nèi)沉積,同時隨著飼糧中汞水平增加,汞沉積量顯著提高(P0.05)。在相同處理組中,汞在腎臟中沉積量最高,肝臟和卵巢中次之。飼糧中汞污染還會造成蛋雞肝臟和腎臟的組織不同程度損傷。此外,27.24 mg/kg汞處理組的血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)(P0.05)和血清球蛋白(GLB)(P0.05)水平均顯著高于0.28和3.33mg/kg汞處理組。同時,27.24mg/kg汞處理組的血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)水平顯著高于其余各處理組(P0.05)。然而,與0.28 mg/kg汞處理組相比,27.24mg/kg汞處理組的血清中白蛋白(ALB)水平和ALB/GLB均顯著降低(P0.05)。此外,3.33,9.42和27.24 mg/kg汞處理組的血清中尿素氮(BUN)(P0.05),肌酐(CRE)(P0.05)和水平尿酸(UA)(P0.05)水平均顯著高于0.28 mg/kg汞處理組。另外,飼糧汞污染會顯著提高蛋雞卵泡閉鎖率(P0.05),并且卵巢中汞的沉積量與卵泡閉鎖率呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P0.01)。3飼糧汞污染對蛋雞肝臟、腎臟和卵巢抗氧化系統(tǒng)的影響本試驗旨在研究飼糧汞污染對蛋雞肝臟、腎臟和卵巢抗氧化系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明,飼糧汞污染可以顯著降低蛋雞肝臟、腎臟和卵巢中超氧化物歧化酶(SOD)(P0.05)、過氧化氫酶(CAT)(P0.05)、谷胱甘肽還原酶(GR)(P0.05)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力(P0.05),以及谷胱甘肽(GSH)水平(P0.05)。然而,蛋雞肝臟、腎臟和卵巢中丙二醛(MDA)水平均顯著升高(P0.05)。同時,飼糧汞污染可以顯著降低蛋雞肝臟中銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)(P0.05)、CAT(P0.05)、GR(P0.05)和GSH-Px(P0.05)基因表達水平,以及蛋雞腎臟和卵巢中銅鋅超氧化物歧化酶CuZnSOD(P0.05)、錳超氧化物歧化酶(MnSOD)(P0.05)、CAT(P0.05)、GR(P0.05)和GSH-Px(P0.05)基因表達水平。飼糧汞污染還可以顯著降低蛋雞肝臟、腎臟和卵巢中轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)基因和蛋白表達(P0.05),反而顯著提高其中胞質(zhì)接頭蛋白(Keapl)基因和蛋白表達(P0.05)。此外,除了肝臟中錳超氧化物歧化酶(MnSOD)基因以外,其他的抗氧化酶活力與抗氧化酶基因表達之間均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.05)。蛋雞肝臟、腎臟和卵巢中Nrf2基因表達與抗氧化酶基因表達之間亦呈顯著正相關(guān)(P0.05),而Nrf2基因、蛋白表達與Keapl之間均呈顯著負相關(guān)(P0.01)。4汞處理對蛋雞孕酮激素分泌的影響研究本試驗旨在研究氯化汞處理對蛋雞卵巢孕酮(P4)激素分泌的影響研究。體內(nèi)試驗結(jié)果表明,飼糧汞污染可以顯著降低卵泡刺激素(FSH)(P0.05)、黃體生成素(LH)(P0.05)和P4激素(P0.05)水平。體外培養(yǎng)卵泡顆粒細胞研究不同汞劑量、不同處理時間對類固醇激素合成酶(StAR)、側(cè)鏈裂解酶(P450scc)和類固醇脫氫酶(3β-HSD),以及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路的影響,進一步探討氯化汞處理對蛋雞P4激素水平影響的分子機制。體外試驗結(jié)果表明,與對照組相比,2、4和6 μM汞處理會顯著降低12 h的P4激素水平(P0.05),且4和6uM汞處理會顯著降低48 h的P4激素水平(P0.05)。與對照組相比,2、4和6μM汞處理會顯著降低12和24h的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平(P0.05)和24h的蛋白激酶A(PKA)水平(P0.05)。同時,與對照組相比,6μM汞處理會顯著降低48 h的cAMP水平(P0.05),以及12和48 h的PKA水平(P0.05)。此外,與對照組相比,2、4和6 μM汞處理還會顯著降低24和48 h類固醇激素合成調(diào)節(jié)蛋白(StAR)(P0.05)、細胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(P450scc)(P0.05)和類固醇脫氫酶(3β-HSD)基因表達水平(P0.05)。通過各指標間相關(guān)性分析結(jié)果表明,在12和24h培養(yǎng)時間,卵巢顆粒細胞內(nèi)P4、cAMP、PKA、StAR、P450scc和3β-HSD水平之間均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.05)。5汞處理對雞胚腎細胞凋亡的影響研究本試驗旨在研究氯化汞處理對雞胚腎臟(CEK)細胞凋亡的影響。體內(nèi)試驗結(jié)果表明,9.42和27.24 mg/kg汞處理組蛋雞的腎臟組織中均出現(xiàn)了不同程度的細胞凋亡。之后進行體外試驗進一步研究氯化汞誘導蛋雞腎臟發(fā)生細胞凋亡的分子機理。體外培養(yǎng)CEK細胞,設(shè)置4個處理組:對照組(0μM汞),5 μM汞處理組、10 μM汞處理組和15 μM汞處理組。同時,應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)處理細胞探索ERS在氯化汞誘導CEK細胞凋亡過程中所起作用,另外設(shè)置4個處理組:對照組(0λM汞),4-PBA處理組,15μM汞處理組和15μM汞+4-PBA處理組。試驗結(jié)果表明,與對照組相比,氯化汞處理會降低CEK細胞培養(yǎng)24h后的致密程度,還會顯著增加細胞核濃縮程度,并且顯著降低CEK細胞活力(P0.05)。與對照組相比,氯化汞處理可以顯著增加CEK細胞凋亡率(P0.05),顯著增加CEK細胞線粒體膜電位降低百分比(P0.05),并且顯著增加Bax/Bcl-2基因表達(P0.05)。然而,當4-PBA與15μM汞共同處理CEK細胞后,CEK細胞活力顯著高于15 μM汞處理組(P0.05);CEK細胞凋亡率會顯著低于15μM汞處理組(P0.05);細胞內(nèi)Bax/Bcl-2基因表達顯著低于15μM汞處理組(P0.05)。此外,與對照組相比,氯化汞處理可以顯著提高CEK細胞內(nèi)GRP78(P0.05)、ATF4(P0.05)和CHOP(P0.05)基因表達和顯著提高GRP78(P0.05)、ATF4(P0.05)、p-PERK/PERK(P0.05)和CHOP(P0.05)蛋白表達。然而,當4-PBA與15μM汞共同處理CEK細胞后,CEK細胞內(nèi)GRP78(P0.05)、ATF4(P0.05)、CHOP(P0.05)基因表達水平和GRP78(P0.05)、ATF4(P0.05)、p-PERK/PERK(P0.05)和CHOP(P0.05)蛋白表達水平均顯著低于15μM汞處理組。以上結(jié)果提示:飼糧汞污染顯著降低蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì),造成蛋雞肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷,并顯著提高卵泡閉鎖率。飼糧汞污染可以通過抑制Nrf2-Keap1通路抑制下游的抗氧化酶基因表達,顯著降低蛋雞肝臟、腎臟和卵巢中抗氧化酶活力,從而損傷蛋雞肝臟、腎臟和卵巢的抗氧化系統(tǒng)。此外,飼糧汞污染會顯著降低血清中FSH、LH和P4水平。體外試驗研究發(fā)現(xiàn),氯化汞可以在時間和劑量依賴下干擾蛋雞卵巢顆粒細胞內(nèi)cAMP-PKA通路和StAR、P450scc和3β-HSD關(guān)鍵基因的表達,從而抑制細胞內(nèi)P4激素的分泌。此外,飼糧汞污染可以誘導蛋雞腎臟發(fā)生細胞凋亡。體外試驗研究發(fā)現(xiàn),氯化汞處理會通過激活CEK細胞內(nèi)ERS相關(guān)的PERK-ATF4-CHOP通路,CHOP因子會增強線粒體中Bax/Bcl-2基因表達來誘導CEK細胞凋亡。
【圖文】：

ｍｇ／ｋｇ邋Ｈｇ邋ｇｒｏｕｐ：邋Ｄ：邋Ｈｅｐａｔｉｃ邋ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋２７．２４邋ｍｇ／ｋｇ邋Ｈｇ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑３．４飼糧中汞污染對蛋雞腎臟損傷的影響逡逑由圖３－２可知，在０．２８邋ｍｇ／ｋｇ汞處理組中，腎小球和腎小管的組織結(jié)構(gòu)正常。逡逑然而，在３．３３，，邋９．４２和２７．２４邋ｍｇ／ｋｇ汞處理組中，腎小球和腎小管的組織結(jié)構(gòu)均出逡逑現(xiàn)不同程度的損傷。隨著飼糧中汞水平的增加，腎小球濃縮程度越來越嚴重，同逡逑時腎小管越來越肥大。此外，在９．４２和２７．２４ｍｇ／ｋｇ汞處理組中，腎小管還出現(xiàn)了逡逑空泡化和纖維化的變化。逡逑３２逡逑

ｇｒｏｕｐ；邋Ｄ：邋Ｒｅｎａｌ邋ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋２７．２４邋ｍｇ／ｋｇ邋Ｈｇ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑３．５飼糧中汞污染對蛋雞卵泡閉鎖率的影響逡逑由圖３－３可知，隨著飼糧中汞水平的增加，卵泡閉鎖率呈先升高之后逐漸平緩，逡逑再升高的趨勢。與０．２８邋ｍｇ／ｋｇ汞處理組相比，３．３３，邋９．４２和２７．２４邋ｍｇ／ｋｇ汞處理組的逡逑卵泡閉鎖率顯著提高（Ｐ＜0．0５）。此外，卵巢中汞的沉積量與卵泡閉鎖率呈顯著的逡逑正相關(guān)關(guān)系（Ｐ＜０．０１）。逡逑３３逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S831.5

【參考文獻】

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本文編號：2606292