【摘要】：1.硼對脾的影響在研究中檢測了硼對脾發(fā)育變化之間的關系和硼(以硼酸的形式)對Hsp40/70表達水平的影響。將30羽健康雛鴕鳥隨機分為6組:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ組,分別飼喂添加0,40,80,160,320,640 mg/L硼的基礎日糧。通過HE染色對脾組織進行病理學檢查;采用IHC和Western blot檢測技術分析Hsp40/70的表達水平;并通過實時熒光定量PCR(qPCR)檢測Hsp40/70的mRNA表達水平。為了研究細胞凋亡,分析了所有處理組的TUNEL反應。該部分研究工作的內容和結果如下:1.1硼對鴕鳥脾組織結構的影響與Ⅰ組的結果相比,Ⅱ組沒有顯著性差異。與Ⅰ組比較,Ⅱ組和Ⅳ組白髓的數(shù)量和體積增多,邊緣區(qū)細胞密集增厚,邊界清晰。試驗組Ⅴ和Ⅵ組織病理學變化明顯;白髓的數(shù)量和體積減少,邊界不清晰。1.2硼對Hsp40/70在雛鴕鳥脾中分布的影響Hsp70主要在脾臟組織中呈彌漫分布。與Ⅰ組的結果相比,Ⅱ組的Hsp70的分布無顯著性差異,但Ⅲ組,特別是飼喂添加160 mg/L硼的Ⅳ組的Hsp70分布差異顯著。然而,高硼處理組的Hsp70陽性信號的分布開始下降,其在Ⅵ下降得猶為明顯。此外,與Ⅰ組相比,Ⅱ組中陽性信號IOD略有增加,但無顯著性差異;Ⅲ組和Ⅳ組中Hsp70陽性信號的IOD顯著性升高。然而,V組陽性信號的IOD卻略有降低,但無顯著性差異,Ⅵ組陽性信號的IOD顯著性降低。通過蛋白免疫印跡分析,Hsp70表達量水平與免疫組化結果的趨勢相似。隨著硼含量的增加,Hsp70s表達量也增加并在Ⅳ組中達到峰值。Hsp40的表達量的趨勢與Hsp70的相似;然而,與Hsp70相比,相同組中Hsp40的表達量較少。這表明Hsp40是Hsp70的輔因子,有助于Hsp70的活性。1.3硼對鴕鳥脾Hsp40/70 mRNA表達量的影響Ⅱ組(40mg/L硼)中Hsp40/70的mRNA表達量水平高于Ⅰ組;Ⅲ組mRNA表達量水平顯著升高;Ⅳ組mRNA表達量水平達到峰值,之后Hsp40/70的mRNA表達量水平開始下降;Ⅵ組的mRNA表達量水平最低,與Ⅰ組(對照組)相近。mRNA表達量下降,表明Hsp40/70 mRNA表達量是呈現(xiàn)劑量依賴性的,最初在較低劑量下誘導表達,然后在較高量的硼處理組中被抑制。1.4硼對鴕鳥脾細胞凋亡的影響為了檢測硼對雛鴕鳥脾細胞凋亡的影響,采用TUNEL法評估細胞凋亡。TUNEL細胞主要是棕色顆粒的細胞。在Ⅱ組,Ⅲ組和Ⅳ組中,TUNEL陽性信號弱于Ⅰ組;但在第Ⅴ組,特別是Ⅴ組(640 mg/L硼)TUNEL陽性信號增強。IOD分析顯示Ⅱ-Ⅳ組水平較低,Ⅳ組最低;而與Ⅰ組相比,Ⅴ組和Ⅵ組的IOD水平顯著升高。2.硼在腎臟組織發(fā)育中的作用在本試驗中,研究了硼對雛鴕鳥腎的作用,特別是抗氧化能力。將48羽雛鴕鳥隨機分為6組,在飲用水中補充不同濃度的硼。測定相對氧化/抗氧化酶(T-AOC,MDA,GSH-Px,CAT,GR,SOD)和腎細胞凋亡各項指標。通過qPCR測量該通路(Nrf2,HO-1和GCLC)中3個重要基因的表達,并通過免疫組化分析關鍵調節(jié)因子Nrf2的定位。研究的相應內容和結果如下:2.1硼對雛鴕鳥腎組織凋亡的影響凋亡的細胞分布在腎的各個部位,這些細胞基本上是棕色顆粒的細胞。與對照組相比,Ⅱ組和Ⅲ組凋亡細胞數(shù)量較少。飼喂添加160mg/L硼基礎日糧處理組凋亡細胞數(shù)量略有增加,當添加劑量達到320mg/L時凋亡細胞數(shù)明顯增加,在640mg/L劑量時達到峰值。此外,IOD分析顯示Ⅱ組和Ⅲ組的水平較低,Ⅲ組水平最低,而與對照組相比,Ⅴ組和Ⅵ組IOD水平顯著升高。2.2硼對雛鴕鳥腎組織抗氧化活性的影響與對照組相比,添加40 mg/L和80 mg/L硼組MDA含量分別顯著降低了26.02%和48.12%,然而添加160-320 mg/L硼時增加,640mg/L硼組增加了一倍。添加40 mg/L硼組雛鴕鳥腎組織T-AOC活性與對照組相比沒有差異,添加80mg/L硼組則明顯升高。相反,添加640mg/L硼組T-AOC活性顯著下降,與同組MDA含量變化相反。雛鴕鳥腎組織的GSH-PX活性在添加40和80mg/L硼組略有增加,但差異不顯著。然而,GSH-PX在添加160,320mg/L硼組顯著增加了約50%,添加640 mg/L硼組增加了 一倍。2.3硼對雛鴕鳥腎組織Nrf2抗氧化通路的影響研究結果表明,在低劑量硼組,Nrf2陽性產(chǎn)物主要分布在腎近端小管,而高劑量組Nrf2陽性產(chǎn)物分布主要位于上皮細胞中。IOD分析顯示,低劑量組Nrf2陽性產(chǎn)物的分布較高,而與Ⅰ組相比,高劑量組的Nrf2p陽性產(chǎn)物分布較少�？寡趸�(Nrf2,HO-1,GCLc)中3個重要基因的qPCR分析顯示不同組之間相似而強烈的差異。與對照組相比,當添加硼達到160mg/L劑量時能顯著提高了雛鴕鳥腎組織中Nrf2的表達水平,添加80 mg/L硼組達到峰值。除了添加40mg/L硼組外,其他添加硼組抗氧化通路GCLc表達量水平均顯著升高,添加80mg/L硼組達到最大值。此外,與其他抗氧化因子相比,硼對雛鴕鳥腎組織中HO-1表達量水平的影響是最大的。3.硼對肝臟功能的影響在非洲鴕鳥飲用水中添加硼酸(Omg,40mg,80mg,160mg,320mg和640mg),觀察并檢測雛鴕鳥肝中由不同劑量硼引起的組織學,細胞凋亡,組織化學和血清生化參數(shù)的變化。通過HE染色和PAS染色評估不同組的組織結構變化;通過TUNEL檢測細胞凋亡情況;通過分光光度法檢測血清生化指標。得到的結果如下:3.1硼對肝組織結構的影響90羽鴕鳥肝顯示出良好的結構,具有豐富的細胞數(shù)量和不同形狀的肝門管區(qū)。在低劑量硼組,進一步發(fā)現(xiàn)肝細胞發(fā)育良好,肝門管區(qū)清晰可見。在高劑量組中觀察到肝組織結構發(fā)生改變。與硼中毒有關的主要病變包括:肝門管區(qū)炎癥和肝細胞病變。肝門管區(qū)炎癥在Ⅵ組最嚴重。在肝組織的一些肝細胞中觀察到輕度癥狀,添加640mg/L硼劑量組中較多。此外,一些肝細胞還觀察到核皰化。同時,還觀察到的部分的核固縮和壞死。3.2硼對糖原含量的影響Ⅱ組糖原含量高于Ⅰ組,Ⅲ組糖原含量最高,有顯著性差異。Ⅳ組可能是最佳劑量,之后糖原量開始下降。與Ⅰ組比較,在Ⅴ組和Ⅵ組中糖原含量最少。經(jīng)IOD分析證實了以上所述各組糖原水平。3.3硼對雛鴕鳥肝細胞凋亡的影響低劑量組顯示較少的細胞凋亡,Ⅱ組中細胞死亡最少。與Ⅰ組相比,高劑量組,特別是添加640mg/L硼組中肝細胞凋亡量較多。IOD的統(tǒng)計學分析與本研究的TUNEL結果相似,表明硼對細胞凋亡具有劑量依賴性作用,并且添加超過160mg的硼劑量會使更多的細胞凋亡。3.4硼對血清生化指標的影響血清生化指標受硼劑量的影響顯著。高劑量組(添加320 mg/L,特別是640mg/L硼組)酶活性參數(shù)與空白組相比差異顯著。同時,參與代謝的血清生化指標在低劑量組(至Ⅳ組)中顯示出硼有利的作用�？傮w結果表明硼在低劑量(80-160mg/L硼酸)對肝酶活性和代謝有正面的影響,高劑量(主要是640mg硼酸/L)則具有相反的作用。簡言之,總體結果表明適當?shù)纳攀撑饠z入量(約160mg)可以使雛鴕鳥各組織發(fā)育良好,提高抗氧化的能力,減少細胞的凋亡和正向調節(jié)各項血清生化指標。然后,高劑量的硼能引起中毒反應并表現(xiàn)出明顯的組織學結構病變。此外,長期超量添加硼會導致HSP表達量下降,糖原消耗過多,細胞凋亡增多和酶活性增加,這些都與硼的作用密切相關。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S839
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本文編號：2605481