【摘要】：背景和目的:H6N6亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在歐亞大陸野生鳥(niǎo)類和家禽廣泛流行,其宿主范圍逐漸擴(kuò)大至哺乳動(dòng)物豬,部分病毒株甚至獲得識(shí)別與結(jié)合人型的能力,有進(jìn)化演變成為直接感染人的潛能,對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅,但到目前為止,H6N6亞型禽流感病毒如何跨種間屏障傳播哺乳動(dòng)物和人仍未清楚。本項(xiàng)目應(yīng)用雞源禽流感病毒H6N6亞型體內(nèi)感染小鼠,體外感染豬和人呼吸道組織,觀察病毒對(duì)小鼠的致病性、在豬和人呼吸道組織復(fù)制及其病理變化,同時(shí)應(yīng)用基因測(cè)序法,比較H6N6病毒各基因片段的變化,篩選H6N6病毒感染小鼠、在豬和人復(fù)制的基因特征,為揭示H6N6亞型禽流感病毒跨種屬感染人的潛能及其有利于病毒在人復(fù)制的關(guān)鍵分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。方法:1.流感病毒的擴(kuò)增及EID_(50、)TCID_(50)檢測(cè):將選定待用3株陸禽雞H6N6亞型禽流感病毒:A/CK/ZZ/346/2014(簡(jiǎn)稱ZZ346);A/CK/JX/20490/2014(簡(jiǎn)稱JX20490);A/CK/ZZ/1923/2015(簡(jiǎn)稱ZZ1923),接種雞胚擴(kuò)增,培養(yǎng)48h后收獲雞胚尿囊液。測(cè)定EID_(50)、TCID_(50)值以明確BALB/c小鼠體內(nèi)感染和體外感染豬和人組織所使用的病毒稀釋度。2.H6N6病毒體內(nèi)感染BALB/c小鼠:通過(guò)鼻腔內(nèi)、眼睛途徑接種小鼠,接種后每天記錄癥狀和體重,1、3、5、7d分別采集咽拭子,3、5、7d分別安樂(lè)處死3只攻毒小鼠,取其肺和氣管,一半用于研磨檢測(cè)病毒滴度,另一半經(jīng)10%福爾馬林固定后,用作HE染色和免疫組化,接種后14d采集其血樣,用于檢測(cè)血清抗體。3.H6N6病毒在體外豬呼吸道組織的復(fù)制:取新鮮豬呼吸道組織,將病毒稀釋液加入豬呼吸道組織,定時(shí)采樣取組織培養(yǎng)上清液及組織塊用于后期流感病毒的分離與鑒定,另取完整組織塊經(jīng)10%福爾馬林固定后,用于HE染色和免疫組化檢測(cè)病毒抗原。4.H6N6病毒在體外人呼吸道組織的復(fù)制:取新鮮人呼吸道組織,將病毒稀釋液加入人呼吸道組織,定時(shí)采樣取培養(yǎng)上清液及組織塊用于后期流感病毒的分離與鑒定,另取完整組織塊經(jīng)10%福爾馬林固定后,用于HE染色和免疫組化檢測(cè)病毒抗原。5.流感病毒的分離:將前期實(shí)驗(yàn)采集用于分離培養(yǎng)的標(biāo)本均分兩份,一份接種雞胚,培養(yǎng)48h后收取雞胚尿囊液,HA試驗(yàn)檢測(cè)尿囊液中病毒滴度;另一份接種于MDCK細(xì)胞,培養(yǎng)72h后收取細(xì)胞培養(yǎng)液,HA試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞液中病毒滴度。6.HI試驗(yàn)檢測(cè)感染動(dòng)物血清抗體:小鼠感染后14d,采用眼球采血方法取適量血樣,離心取上層血清,應(yīng)用HI試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體。7.HE染色觀察動(dòng)物、組織感染病毒的病理變化:取上述麻醉安樂(lè)處死小鼠的呼吸道組織、體外感染豬和人呼吸道組織,組織固定、切片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。8.免疫組化檢測(cè)病毒抗原:取上述安樂(lè)處死小鼠的呼吸道組織、體外感染豬和人呼吸道組織,組織固定、切片,免疫組化染色檢測(cè)病毒抗原。9.基因測(cè)序和篩選關(guān)鍵基因標(biāo)記:提取病毒RNA,PCR反應(yīng)擴(kuò)增,純化產(chǎn)物,采用Illumina的Solexa系統(tǒng)上機(jī)測(cè)序病毒全基因,使用全球共享流感數(shù)據(jù)庫(kù)(Global initiative on sharing all influenza data,GISAID)準(zhǔn)備相關(guān)病毒數(shù)據(jù),用Bioedit進(jìn)行序列比較和同源性分析H6N6亞型AIV基因片段的變化,篩選對(duì)小鼠致病性以及在豬和人呼吸道組織復(fù)制的基因特點(diǎn)。結(jié)果:1.小鼠感染實(shí)驗(yàn)中,ZZ346病毒株可在小鼠體內(nèi)有效復(fù)制,呼吸道組織研磨液接種雞胚和MDCK細(xì)胞后,病毒分離培養(yǎng)呈陽(yáng)性;HE染色顯示攻毒后小鼠氣管中有細(xì)胞壞死脫落,肺組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)等現(xiàn)象;免疫組化顯示呼吸道氣管至肺泡組織細(xì)胞內(nèi)病毒NP抗原陽(yáng)性。JX20490病毒株感染小鼠后,呼吸道組織研磨液接種雞胚和MDCK細(xì)胞,病毒分離培養(yǎng)結(jié)果呈陰性;HE染色顯示小鼠攻毒后氣上皮細(xì)胞壞死脫落,但是肺組織未見(jiàn)明顯病理改變;免疫組化顯示氣管上皮細(xì)胞內(nèi)病毒NP抗原陽(yáng)性,而肺組織NP抗原陰性。然而,ZZ1923病毒株各項(xiàng)檢測(cè)均為陰性。攻毒14d的小鼠血樣,經(jīng)HI實(shí)驗(yàn)檢測(cè),3株病毒的所有小鼠血清樣本中均呈抗體陽(yáng)性。2.流感病毒在豬體外呼吸道復(fù)制中,3株雞H6N6亞型AIV感染后的組織樣本,經(jīng)雞胚接種后病毒分離檢測(cè)呈陽(yáng)性,HE染色顯示感染后出現(xiàn)肺局部細(xì)胞壞死,免疫組化顯示肺泡細(xì)胞內(nèi)病毒NP抗原陽(yáng)性。3.流感病毒在人體外呼吸道復(fù)制中,3株雞H6N6亞型AIV感染后的組織樣本,經(jīng)雞胚接種后病毒分離檢測(cè)呈陽(yáng)性。ZZ346病毒株感染后的肺組織切片,HE染色顯示感染后均出現(xiàn)局部細(xì)胞壞死,免疫組化顯示細(xì)胞內(nèi)病毒NP抗原陽(yáng)性,而接種JX20490、ZZ1923病毒株的肺組織切片未出現(xiàn)明顯病理改變、未檢測(cè)出病毒NP抗原。4.基因測(cè)序分析,3株雞H6N6亞型AIV的HA裂解位點(diǎn)模式均為PQIETG/GL,顯示單個(gè)堿性氨基酸切割位點(diǎn)的特征,屬低致病性病毒,3株雞的HA均出現(xiàn)P186T突變,但唯有ZZ346病毒株的HA158位點(diǎn)有氨基酸缺失以及NA頸區(qū)出現(xiàn)11個(gè)氨基酸(59-69)缺失。結(jié)論:1.雞源H6N6亞型流感病毒可在小鼠呼吸道有效復(fù)制、引發(fā)呼吸道炎癥病變,表明雞源H6N6亞型流感病毒可跨種屬間屏障直接感染小鼠。2.雞源H6N6亞型流感病毒可在體外豬組織有效復(fù)制,其中ZZ346病毒株均可在豬和人肺組織有效復(fù)制,提示該病毒株具有感染豬和人的潛能以及與人型SA-α2,6-Gal受體結(jié)合的傾向。3.H6N6亞型AIV的HA裂解位點(diǎn)模式屬低致病性病毒,ZZ346病毒株HA出現(xiàn)P186T突變、HA158位點(diǎn)有氨基酸缺失以及NA頸區(qū)出現(xiàn)11個(gè)氨基酸(59-69)缺失,結(jié)合ZZ346病毒株均可在人肺泡組織有效復(fù)制的結(jié)果,提示上述基因位點(diǎn)改變有助于H6N6亞型AIV在人肺泡組織有效復(fù)制。
【圖文】：

病毒 H6N6 亞型對(duì)小鼠致病性以及在豬和人呼吸道組織復(fù)制的研究 2019 屆碩/c 小鼠體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果后小鼠臨床癥狀改變及體重變化情況B/c 小鼠接種病毒后，，經(jīng)觀察可見(jiàn)其表現(xiàn)出活動(dòng)減少、飲亂、呼吸較急促等臨床癥狀，但此類臨床癥狀一般 3-5 后的第一天體重下降，隨后緩慢恢復(fù)并逐漸升高，其變示。

36圖 1-2 3 株 H6N6 AIV 感染小鼠肺組織 HE 染色結(jié)果，200×。A：ZZ346 感染小鼠肺組織出現(xiàn)血管充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；B：JX20490 感染小鼠肺無(wú)明顯病變；C：ZZ1923 感染小鼠肺無(wú)明顯病變D: 陽(yáng)性對(duì)照組：肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)；E：空白對(duì)照組。Figure 1-2 Results of HE staining in lung tissues of 3 strains of H6N6 AIV infected mice, 200×. Apulmonary tissue of ZZ346 infected mice showed vascular congestion and inflammatory reaction; BJX20490 infected mice showed no obvious lung lesions; C: no obvious pulmonary lesions were found ithe infected mice ZZ1923; D: positive control group; E: blank control group.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2604401