【摘要】：狂犬病病毒屬于彈狀病毒科-狂犬病病毒屬,感染一切溫血動物,在全球范圍內(nèi)均有流行,狂犬病為人獸共患病,一旦發(fā)病,無有效治療藥物,致死率幾乎100%。我國野生動物狂犬病流行情況尚無詳細數(shù)據(jù),但時有由野生動物咬傷導(dǎo)致的人狂犬病發(fā)病死亡病例發(fā)生,也有從死亡野生動物尸體標(biāo)本分離到狂犬病病毒的情況,說明我國野生動物存在狂犬病流行。據(jù)歐美等發(fā)達國家防控經(jīng)驗,消滅野生動物狂犬病的有效途徑是野外投放口服狂犬病疫苗,而我國尚無野生動物口服狂犬病疫苗使用,目前市售產(chǎn)品有滅活疫苗或減毒活疫苗,均為肌肉注射,不適用于野生動物。因此研制可規(guī)模化生產(chǎn)的野生動物口服狂犬病疫苗對我國野生動物狂犬病的防控具有重要意義。針對上述內(nèi)容,本研究開展了以下試驗:1.狂犬病病毒減毒株的篩選。試驗內(nèi)容:①毒株在鼠腦連續(xù)傳代。對分離自我國寧夏地區(qū)的一株狂犬病病毒CNX8601株在鼠腦連續(xù)傳代,檢測病毒潛伏期、病毒滴度和外周致病性。②毒株在Vero細胞連續(xù)傳代。對鼠腦適應(yīng)CNX-M株在Vero細胞上進行連續(xù)傳代,檢測病毒潛伏期、病毒滴度和外周致病性。③減毒株篩選及純化。應(yīng)用蝕斑法篩選5株減毒株,進行初步致病性及免疫原性評價。2.生物反應(yīng)器培養(yǎng)高免疫原性狂犬病病毒。試驗內(nèi)容:①生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)Vero細胞。應(yīng)用NBS公司14L生物反應(yīng)器及片狀載體灌流式培養(yǎng)Vero細胞,摸索細胞培養(yǎng)條件,通過14個批次試驗,確定pH、Do、溫度、培養(yǎng)基灌流速度等參數(shù)。②生物反應(yīng)器狂犬病病毒培養(yǎng)。以Vero細胞為基質(zhì),應(yīng)用NBS公司14L生物反應(yīng)器及片狀載體灌流式培養(yǎng)收獲病毒液,通過9個批次試驗,確定加毒時間、病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)、病毒收獲時間等參數(shù)。③熒光法病毒滴度檢測方法的建立。3.脂質(zhì)體口服減毒活疫苗的制備及性質(zhì)考察。試驗內(nèi)容:①疫苗的配制。應(yīng)用反相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體,脂質(zhì)體與減毒活疫苗1:1配比后,凍干制成脂質(zhì)體減毒活疫苗。②電鏡觀察脂質(zhì)體包裹病毒顆粒形態(tài),檢測粒徑分布并檢測粒徑大小。4.脂質(zhì)體口服減毒活疫苗在小鼠體內(nèi)免疫效果觀察。試驗內(nèi)容:制備減毒活疫苗及脂質(zhì)體減毒活疫苗,分別對小鼠進行口服免疫,檢測小鼠體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體水平及細胞免疫水平。5.脂質(zhì)體口服減毒活疫苗的免疫劑量。試驗內(nèi)容:以比格犬為動物模型,以雞頭為誘餌,分2ml、4ml和8ml劑量口服免疫脂質(zhì)體減毒活疫苗,檢測陽轉(zhuǎn)率、血清中和抗體水平及免疫持久性。通過以上實驗,獲得以下結(jié)果:1.狂犬病病毒減毒株篩選結(jié)果顯示:①CNX8601株在鼠腦連續(xù)傳代50代,命名為CNX-M,其潛伏期由起始的11～14天,穩(wěn)定到5～7天;病毒滴度能達到5.671gLD50/0.03ml,皮下致病力為1.51gLD50/0.03ml,將街毒適應(yīng)為鼠腦固定毒。②鼠腦適應(yīng)的固定毒通過Vero細胞適應(yīng)傳代50代,命名為CNX-V,其病毒滴度逐漸上升,能達到6.31gLD50/0.03ml,皮下致病力為1.51gLD50/0.03ml,將腦固定毒適應(yīng)為細胞培養(yǎng)毒株。③用CNX-V株進行蝕斑純化及鼠腦回傳提高病毒滴度,篩選出一株減毒株,命名為CNX-V-5,小鼠口服一次0.2ml,無小鼠致病性,中和抗體水平達到1.5IU/ml,陽轉(zhuǎn)率達到90%。2.生物反應(yīng)器培養(yǎng)高免疫原性狂犬病病毒結(jié)果確定以下工藝參數(shù):①Vero細胞接種密度為4～6×106個/ml,細胞培養(yǎng)階段各參數(shù)設(shè)定值為pH7.2、溶氧70%、攪拌轉(zhuǎn)速100rpm、葡萄糖維持在0.5。②CNX-V-5毒株的感染復(fù)數(shù)為0.1,病毒培養(yǎng)階段的各參數(shù)設(shè)定值為pH7.4、溶氧70%、攪拌轉(zhuǎn)速100rpm、葡萄糖維持在0.3。3.脂質(zhì)體口服減毒活疫苗的制備及性質(zhì)考察結(jié)果顯示,透射電鏡觀察可見本方法制備的脂質(zhì)體粒徑分布均勻,呈圓形或橢圓形,狂犬病毒脂質(zhì)體平均粒徑為14.25μm左右,平均包封率為68.6±3.68%。4.小鼠體內(nèi)免疫效果研究結(jié)果顯示:①所有32只小鼠均未見發(fā)病情況,說明該減毒疫苗沒有對小鼠產(chǎn)生致病性。②中和抗體比較:脂質(zhì)體減毒活疫苗組中和抗體1-6個月穩(wěn)定維持在3IU,滅活疫苗中和抗體水平持續(xù)在2IU,兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。③致T淋巴細胞亞群分型:脂質(zhì)體減毒活疫苗組CD3+,CD4+比例均高于減毒活疫苗組。脂質(zhì)體減毒活疫苗組與減毒活疫苗組之間比較CD4+/CD8+,p0.05,差異有顯著意義。④NK細胞活性:減毒活疫苗組與脂質(zhì)體減毒活疫苗組之間比較,t=0.301,p0.05,差異無顯著意義。⑤IL-2檢測:脂質(zhì)體減毒活疫苗組同減毒活疫苗組比較,t=2.55,p0.05,有顯著性差異。⑥IFN-γ檢測:脂質(zhì)體減毒活疫苗組同減毒活疫苗比較,t=3.33,p0.01,差異有非常顯著性意義。5.脂質(zhì)體口服減毒活疫苗的免疫劑量研究結(jié)果顯示:①陽轉(zhuǎn)率觀察:2ml劑量組第1個月陽轉(zhuǎn)率為100%,第3個月為80%,到第6個月降至60%,第15個月降至30%;4ml劑量組前3個月陽轉(zhuǎn)率均為100%,前12個月為90%,第15個月為80%;8ml劑量組前9個月陽轉(zhuǎn)率均為100%,第15個月為90%。②中和抗體水平:8ml劑量組中和抗體水平最高,4ml劑量組居中,2ml劑量組中和抗體水平最低,同時隨免疫后時間的延長,3組的中和抗體水平均呈下降趨勢。通過以上結(jié)果,得出以下結(jié)論:1.成功篩選和適應(yīng)了狂犬病病毒減毒疫苗株:CNX-V-5,應(yīng)用該毒株制備的減毒活疫苗未能對小鼠和犬產(chǎn)生致病性,同時可誘導(dǎo)小鼠和犬產(chǎn)生具有保護性的中和抗體。2.建立了生物反應(yīng)器規(guī)�；囵B(yǎng)狂犬病病毒的生產(chǎn)工藝,該工藝的建立為野生動物脂質(zhì)體口服減毒活疫苗的規(guī)�；囵B(yǎng)提供了技術(shù)支持,同時也將降低將來大規(guī)模使用的生產(chǎn)成本。3.建立了脂質(zhì)體的制備方法,將此脂質(zhì)體溶液與病毒收獲液等體積混合,凍干制備脂質(zhì)體口服減毒活疫苗。該疫苗的脂質(zhì)體包封率為68%左右,平均粒徑為14.25μm。4.脂質(zhì)體作為狂犬病減毒活疫苗的佐劑,以小鼠為動物模型,對小鼠體內(nèi)的中和抗體及細胞免疫均起到了加強作用。5.以犬為動物模型,初步摸索了脂質(zhì)體口服減毒活疫苗的使用劑量及投放誘餌,試驗結(jié)果表明以雞頭為誘餌,4ml和8ml的免疫劑量均產(chǎn)生較好的免疫效果。論文創(chuàng)新點:1.為我國野生動物疫苗生產(chǎn)獲得了第一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)、免疫原性好的狂犬病疫苗減毒株候選株。2.完成Vero細胞生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)的研究,建立Vero細胞高密度培養(yǎng)工藝,Vero細胞培養(yǎng)密度107個/ml,是常規(guī)培養(yǎng)細胞密度106個/ml的10倍。3.首次將脂質(zhì)體作為佐劑,應(yīng)用于口服狂犬病疫苗,并證明了其通過口腔免疫具有顯著的體液免疫和細胞免疫增強作用。4.首次制備了可工業(yè)化生產(chǎn)的野生動物口服狂犬病疫苗,填補了我國野生動物狂犬病疫苗的空白。
【圖文】：

毒的ＲＮＡ及核蛋白Ｎ，磷蛋白Ｐ以及Ｌ聚合酶共同構(gòu)成。Ｍ蛋白將核衣殼和病毒脂雙逡逑層外膜連接起來。Ｇ蛋白是一種同源三聚體跨膜糖蛋白，，在狂犬病毒外殼上形成刺突，逡逑它含有可被宿主細胞識別的結(jié)構(gòu)域，同時與狂犬病毒的嗜神經(jīng)性和致病性相關(guān)。見圖１－逡逑１0逡逑－５邋－逡逑

圖２－１免疫熒光灶抑制試驗檢測中和抗體水平逡逑Ａ：邋８０％病毒感染熒光灶；Ｂ：邋６０％病毒感染熒光灶；逡逑Ｃ：邋３０％病毒感染焚光灶；Ｄ５％病毒感染焚光灶逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ邋ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ邋ｂｙ邋ＲＦＦＩＴ逡逑Ａ：８０％邋ｖｉｒｕｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｆｏｃｉ；邋Ｂ：６０％邋ｖｉｒｕｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｆｏｃｉ；逡逑Ｃ：３０％邋ｖｉｒｕｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｆｏｃｉ；邋Ｄ５％邋ｖｉｒｕｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｆｏｃｉ逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.9

【參考文獻】

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本文編號：2604397