【摘要】：禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是一種重要的致瘤性反轉(zhuǎn)錄病毒,可以引起雞的多種腫瘤,嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。雞源禽白血病病毒包括A~E,J和K 7個亞群。不同亞群的禽白血病病毒常常具有不同的致病性和致瘤譜,A、B亞群病毒主要誘發(fā)經(jīng)典的雞淋巴細胞瘤,J亞群病毒主要誘發(fā)雞髓細胞瘤,盡管有時它們也誘發(fā)其他類型的腫瘤。近20年來,我國報道和研究了大量的ALV-J引起的髓細胞瘤和血管瘤型禽白血病。然而,對其他亞群的禽白血病的相關(guān)報道則相對較少,目前尚未見關(guān)于ALV-K誘發(fā)的腫瘤病變報道和ALV-A誘發(fā)髓細胞瘤的自然病例報道。本研究對湖北某蛋雞群和某地方品種雞群的腫瘤病雞進行了病理學觀察、病原分離鑒定和病毒全基因特征分析。在此基礎(chǔ)上,通過反向遺傳操作技術(shù),拯救出基因背景清楚的病毒并研究病毒的致病性和致瘤特征,通過轉(zhuǎn)錄組測序分析,了解ALV-A誘發(fā)雞髓細胞瘤的機制,結(jié)果如下:1.自然病例病理學觀察及病原檢測對病雞進行了組織學觀察和病原學檢測。ELISA結(jié)果顯示,商品蛋雞場和地方品種雞自然病例的泄殖腔拭子均呈ALV P27陽性;病理組織學觀察顯示,來自商品蛋雞場和來自地方品種雞養(yǎng)殖場的病雞均為髓細胞瘤混發(fā)淋巴細胞瘤。用ALV-A/B/J的特異性引物進行Multi-PCR檢測,蛋雞病料中擴增出與ALV-A對應的核酸片段,但地方品種雞病料未擴增出片段。以ALV-env的通用引物進行PCR,從地方品種雞病料擴增出了相應的片段,測序顯示擴增出的env與ALV-K原型株JS11C1高度同源。2.病毒分離鑒定與分離株培養(yǎng)特性取兩個雞群中病變典型的病雞肝臟組織,制備組織懸液接種DF-1細胞進行病毒分離培養(yǎng),分別以抗ALV-A的單抗AF3、抗ALV-J的單抗JE9和抗ALV-K SU的單因子血清為一抗進行間接免疫熒光試驗。結(jié)果,以AF3為一抗,用蛋雞肝臟組織懸液處理的DF-1細胞和以抗ALV-K SU單因子血清為一抗,用地方品種雞肝組織懸液處理的DF-1細胞呈亮綠熒光,表明從蛋雞中分離的病毒為ALV-A,命名為HB2015012;從地方品種雞中分離的病毒為ALV-K,命名為HB2015032。體外培養(yǎng)試驗表明,HB2015012和HB2015032與ALV-J參考毒株HB2010001和HB2015029復制特性相似,且HB2015032可以感染荊江麻鴨鴨胚原代成纖維細胞(DEF)。3.病毒分離株基因組特征測序結(jié)果顯示,HB2015012和HB2015032的前病毒基因組全長分別為7735bp和7703bp,二者均具有典型的C型反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)。序列分析顯示,HB2015012和HB2015032的gag和pol基因核苷酸序列均相對保守,但HB2015032的pol基因區(qū)域(前病毒基因組第5345位堿基)發(fā)生了一個C-T突變,提前形成了一個TAA終止密碼子,使得其pol基因編碼的蛋白與J亞群禽白血病病毒一樣,相對于其他亞群的毒株短22aa;HB2015012和HB2015032的UTR+LTR區(qū)核苷酸序列與ALV-J相應區(qū)域高度相似,二者的3’UTR+LTR區(qū)均包含有完整的DR1,E原件,U3,R和U5區(qū),且U3區(qū)均具有2個CAAT boxes、2個Y boxes、2個CArG boxes和2個PRE boxes及1個NFAP-1和TATA box,幾乎含有ALV-J原型株HPRS-103 U3區(qū)所有的調(diào)控序列,另外HB2015032的E原件中(前病毒基因組7250位與7251位堿基間)相對與HPRS-103基因組的7388位堿基處具有1個堿基缺失,形成了一個僅在蛋雞血管瘤型ALV-J毒株中存在的與血管內(nèi)皮細胞分化相關(guān)的c-Ets-1位點。這些結(jié)果表明,HB2015012是由ALV-A與ALV-J重組產(chǎn)生的具有ALV-J3’UTR+LTR的自然重組病毒;HB2015032是ALV-K與ALV-J重組產(chǎn)生的以ALV-J為骨架的K亞群禽白血病病毒,且其E原件可能源自致血管瘤型ALV-J。4.病毒反向遺傳體系的建立及病毒拯救將HB2015012和HB2015032前病毒基因全長DNA插入pTopo-Blunt simple載體,構(gòu)建感染性克隆,轉(zhuǎn)化DF-1細胞,進行病毒拯救。結(jié)果成功拯救出了具有感染性的病毒rHB2015012和rHB2015032。體外培養(yǎng)試驗顯示rHB2015012和rHB2015032均與母本病毒具有相似的體外復制能力。5.rHB2015012和rHB2015032的致病性將rHB2015012和rHB2015032以2×10~3TCID_(50)接種SPF雞進行病毒致病性試驗。rHB2015012接種的試驗雞,腫瘤發(fā)生率為65%,其中髓細胞瘤發(fā)生率為40%;rHB2015032接種的試驗雞,腫瘤發(fā)生率為75%,其中髓細胞瘤發(fā)生率為50%。水平傳播感染rHB2015012的對照組雞的腫瘤總體發(fā)生率為35%,髓細胞瘤發(fā)生率為15%,水平傳播感染rHB2015032的對照組雞的腫瘤總體發(fā)生率為55%,髓細胞瘤發(fā)生率為20%。表明rHB2015012和rHB2015032均可誘發(fā)雞的髓細胞瘤,且rHB2015032的水平傳播及致瘤能力強于rHB2015012。6.ALV-A/J/K及ALV-A、ALV-K自然重組病毒Multi-PCR檢測方法建立ALV-K是近年從中國地方雞群中分離鑒定的一個新亞群,可能由于常常不引起臨床癥狀或僅引起雞的亞臨床癥狀而被長期忽視。目前尚未見關(guān)于其PCR檢測方法的報道,本研究建立了針對ALV-A/J/K的Multi-PCR檢測方法和針對具有J亞群LTR的重組ALV-A/K毒株的Multi-PCR檢測方法。特異性試驗和靈敏性試驗結(jié)果表明,所建立的Multi-PCR檢測方法特異性和靈敏性良好,靈敏性均可達10~2copies/μL,可用于臨床樣本檢驗。7.rHB 2015012感染及肝臟轉(zhuǎn)錄組學分析rHB2015012感染雞肝臟組織RNA-Seq高通量測序轉(zhuǎn)錄組分析,共篩選到1825個差異表達基因(DEG),其中1288個為上調(diào)表達基因,537個為下調(diào)表達基因。GO和KEGG Pathway注釋和富集結(jié)果顯示,部分差異基因與細胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程及免疫應答反應等重要功能相關(guān)。進一步分析顯示這些基因主要參與的信號通路有癌癥相關(guān)通路、破骨細胞分化通路、JAK-STAT信號通路、PI3K-Akt信號通路等。具體而言,癌癥相關(guān)通路富集到85個DEG,PI3K-Akt信號通路富集到76個DEG,破骨細胞分化通路富集到72個相關(guān)的DEG,與造血細胞系相關(guān)(Hematopoietic cell lineage)DEG有30個,細胞粘附分子相關(guān)(Cell adhesion molecules(CAMs))DEG有36個。其中,破骨細胞分化通路富集的72個DEG使與髓細胞瘤密切相關(guān)的JAK-STAT信號通路被激活,Acute myeloid leukemia通路里富集了17個DEG,大多數(shù)與阻礙造血細胞分化(block of differentiation)相關(guān),也可能與髓細胞瘤的形成有關(guān)。MAPK signaling pathway中P53 signaling pathway處于抑制狀態(tài),而PI3K-Akt signaling pathway呈激活狀態(tài),可促進細胞原癌基因myc(c-myc)的增殖,促進髓細胞瘤形成。
【圖文】：

白血病病毒粒子理化特征病病毒粒子大小不等，粒子直徑介于 80~120 nm 之間，主要圖 1-1 ALV 分類地位圖Fig.1-1 Classification ofALV in Retroviride

表 1-2 禽白血病各亞群Table1-2 Subgroups of the avian leukosis virus類型 代表株 原始宿主 外源性 RAV-1 雞 淋圖 1-2 禽白血病病毒結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1-2 Virion diagram of avian leukosis virusFrom http://so.baike.com/s/tupian/
【學位授予單位】：長江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2603866