【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)為球狀或短桿狀的革蘭陰性菌,根據(jù)其莢膜血清型可以被分為A、B、D、E和F共5個血清型,根據(jù)菌體抗原可以分為1~16個血清型。從2006年至今,主要危害我國肉牛產(chǎn)業(yè)的是牛源A型多殺性巴氏桿菌(牛源PmA)。牛源PmA是一種條件致病菌,主要引起犢牛肺炎和成年牛呼吸道綜合征。目前國內(nèi)對于牛源A型多殺性巴氏桿菌病的防控措施還十分有限,每年因為該病導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重危害肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展。該病在獸醫(yī)臨床上主要表現(xiàn)為明顯的肺部病變,可能因為肺部細(xì)菌定殖密度顯著高于其它感染臟器。而造成該現(xiàn)象的其中一個原因可能是感染后的肺部中某些物質(zhì)含量與其它感染臟器存在顯著差異。通過將感染后的肺部與其它感染臟器的物質(zhì)組成進(jìn)行對比,也許就能找到影響該疾病的關(guān)鍵物質(zhì)。為了找到潛在的作用物質(zhì),本研究首先使用牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ2)建立了不同攻毒途徑的小鼠肺炎模型�；谠撃Ｐ�,本研究測定了各臟器細(xì)菌定殖密度,利用代謝組技術(shù)對感染后的小鼠肺部和肝臟組織間差異物質(zhì)進(jìn)行分析,再通過體外試驗找到能影響牛源PmA感染的物質(zhì),最后通過外源添加的方式來檢驗該物質(zhì)是否能影響宿主感染過程,探究該物質(zhì)對細(xì)菌和宿主的潛在作用。具體結(jié)果如下:1.小鼠牛源A型多殺性巴氏桿菌肺炎感染模型的建立及各臟器定殖情況1.1不同攻毒途徑均能成功建立小鼠肺炎模型本研究使用了10~4CFU的PmCQ2分別通過模擬自然感染途徑(滴鼻感染)和非自然感染途徑(肌肉和腹腔感染)對小鼠進(jìn)行攻毒。綜合小鼠的死亡率、臨床表現(xiàn)、肺部病理變化以及肺部HE染色結(jié)果來判斷是否成功建立小鼠肺炎模型。結(jié)果顯示:PmCQ2的致死率極高;小鼠感染PmCQ2以后會出現(xiàn)較明顯的呼吸道癥狀,且肺部會出現(xiàn)如牛肺部一樣的肝變;HE染色結(jié)果顯示三種途徑下均能導(dǎo)致肺部固有組織結(jié)構(gòu)損傷,并出現(xiàn)牛肺部感染類似的中性粒細(xì)胞為主的炎性病變。上述結(jié)果證明,自然感染途徑和非自然感染途徑均能成功建立小鼠牛源PmA肺炎感染模型。1.2 PmCQ2感染后在小鼠肺部定殖密度最高本試驗進(jìn)一步研究了PmCQ2經(jīng)三種攻毒途徑在小鼠體內(nèi)各臟器(肺、肝、脾和腎臟)的定殖密度,并通過PCR對PmCQ2進(jìn)行了驗證。結(jié)果顯示,不同途徑感染具有菌血癥現(xiàn)象;在滴鼻感染(模擬自然感染)途徑下PmCQ2能夠在各臟器中定殖,且各臟器細(xì)菌定殖密度隨著時間的增長逐步上升。PmCQ2在肺部的定殖密度要顯著地高于其它臟器;在肌肉和腹腔攻毒(非自然感染)途徑下PmCQ2也能夠在各臟器中定殖,各臟器細(xì)菌定殖密度同樣隨時間增長而上升。肺部細(xì)菌定殖密度顯著高于肝臟和腎臟,與脾臟定殖密度無顯著性差異,但考慮到脾臟的血濾功能會影響定殖結(jié)果,故依然認(rèn)為肺部定殖密度較其它臟器更高。綜上,PmCQ2感染后在小鼠肺部定殖密度最高。2.代謝組學(xué)分析及差異代謝物質(zhì)的篩選2.1代謝組學(xué)分析利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對8只感染PmCQ2后的小鼠肺臟和肝臟代謝產(chǎn)物進(jìn)行測定;利用統(tǒng)計學(xué)軟件對本次代謝組學(xué)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量分析,并對差異物質(zhì)進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示,本次代謝組學(xué)分析的兩組樣品之間差異性顯著,絕大部分樣品都處于95%的置信區(qū)間,OPLS-DA模型準(zhǔn)確且穩(wěn)定,說明本次代謝組學(xué)分析結(jié)果穩(wěn)定可信,所得數(shù)據(jù)適合進(jìn)一步分析。本次檢測共篩選到253種差異物質(zhì),有99種能夠匹配到數(shù)據(jù)庫中。2.2 L-抗壞血酸和L-天冬氨酸能影響牛源PmA生長利用細(xì)菌生長分析儀Bactrac4300篩選能影響PmCQ2生長的差異物質(zhì)。再利用篩選到的物質(zhì)在體外制作PmCQ2的生長曲線,并通過平板計數(shù)的方式確定作用大小。結(jié)果顯示,僅L-抗壞血酸和L-天冬氨酸能影響PmCQ2的生長。在代謝組學(xué)結(jié)果中,L-天冬氨酸在感染后的肺臟中更多,對PmCQ2生長起劑量依耐性的促進(jìn)作用;相反,L-抗壞血酸在感染后的肝臟中更多,對PmCQ2生長起劑量依耐性的抑制作用,并在2mg/mL時起到了殺菌作用。上述結(jié)果顯示,L-抗壞血酸對牛源PmA的生長具有強大的抑制作用,而L-天冬氨酸對牛源PmA具有促進(jìn)作用,兩者在各自臟器中的含量與細(xì)菌定殖密度成正相關(guān)。3.外源添加L-抗壞血酸和L-天冬氨酸在牛源A型巴氏桿菌感染中的作用3.1 L-抗壞血酸和L-天冬氨酸能影響牛源PmA相關(guān)毒力基因表達(dá)為了研究L-抗壞血酸和L-天冬氨酸對細(xì)菌毒力的影響,本研究對PmCQ2的一些毒力基因和生物膜形成進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,低濃度L-天冬氨酸能促進(jìn)PmCQ2部分毒力相關(guān)基因的表達(dá)和生物膜形成;而L-抗壞血酸能夠抑制OmpA和oma87毒力相關(guān)基因的表達(dá)及生物膜的形成。此外,感染后的肺臟中OmpA表達(dá)量要顯著性高于感染后的肝臟。因此,L-天冬氨酸可能會增強牛源PmA毒力,而L-抗壞血酸能抑制牛源PmA毒力。3.2感染PmA會影響L-抗壞血酸和L-天冬氨酸代謝為了研究感染過程中L-抗壞血酸和L-天冬氨酸的代謝是否發(fā)生變化。本研究測定了感染后小鼠肝臟內(nèi)源L-抗壞血酸產(chǎn)生基因Gulo的表達(dá)量和感染前后L-抗壞血酸組織含量,以及感染后肺部L-天冬氨酸代謝通路相關(guān)基因表達(dá)量。結(jié)果顯示,不同感染途徑下小鼠肝臟Gulo基因的表達(dá)量發(fā)生了下調(diào),感染前后肺部L-抗壞血酸水平也發(fā)生了下調(diào),L-天冬氨酸代謝發(fā)生了富集。上述結(jié)果表明,在感染后小鼠內(nèi)源性L-抗壞血酸合成發(fā)生了抑制;小鼠肺部L-天冬氨酸代謝在感染后會發(fā)生顯著性變化。3.3添加外源L-抗壞血酸對小鼠具有保護(hù)作用為研究外源L-抗壞血酸和L-天冬氨酸在動物水平對PmCQ2感染的影響,本研究測定了添加外源L-抗壞血酸和L-天冬氨酸后小鼠肺部臟器定殖量和小鼠生存曲線。結(jié)果顯示,與對照組相比,添加L-抗壞血酸后降低了小鼠肺部PmCQ2定殖密度,提高了小鼠生存率;添加L-天冬氨酸不能影響小鼠肺部PmCQ2定殖密度和生存率。上述結(jié)果顯示,添加外源L-抗壞血酸能降低小鼠肺部PmCQ2定殖,對小鼠具有保護(hù)作用。3.4 L-抗壞血酸加強巨噬細(xì)胞對PmCQ2的吞噬殺傷作用為了研究L-抗壞血酸和L-天冬氨酸對巨噬細(xì)胞對PmCQ2吞噬殺傷作用的影響。本研究首先通過添加不同劑量的L-抗壞血酸和L-天冬氨酸來判斷其對小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的活性是否有影響,隨后選擇適當(dāng)濃度處理巨噬細(xì)胞,測定巨噬細(xì)胞對PmCQ2的吞噬殺傷作用。結(jié)果顯示,低濃度L-抗壞血酸能夠提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性;100μg/mL的L-抗壞血酸能顯著提高巨噬細(xì)胞對PmCQ2的吞噬殺傷能力;L-天冬氨酸不會抑制細(xì)胞活性,也不影響巨噬細(xì)胞對PmCQ2的吞噬殺傷能力。結(jié)果表明,添加L-抗壞血酸能增強巨噬細(xì)胞對PmCQ2的吞噬殺傷作用。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)PmCQ2感染小鼠后會在多個臟器定殖,其中肺部定殖密度最高。通過比較不同定殖密度的臟器發(fā)現(xiàn),感染后肝臟較多的L-抗壞血酸(抑制)和肺部較多的L-天冬氨酸(促進(jìn))均能影響PmCQ2的生長。添加外源L-抗壞血酸能抑制PmCQ2毒力,提高巨噬細(xì)胞吞噬殺傷能力,給動物起到保護(hù)作用,可作為牛源A型多殺性巴氏桿菌病防控的潛在候選物。
【圖文】：

攻毒途徑小鼠臨床癥狀和眼觀病理變化是自然感染途徑還是非自然感染途徑，各組小鼠感染 PmCQ，發(fā)毛不整，蜷縮不動，體溫降低，不再采食和眼屎增加的咳嗽和腹式呼吸癥狀。將瀕死狀態(tài)和對照組小鼠解剖后發(fā)現(xiàn)肺部都出現(xiàn)了與牛 A 型多殺性巴氏桿菌感染臨床癥狀一致情況，，個別肺部與胸腔粘粘，胸腔中有積液（圖 3.1）。滴鼻感染小鼠肺臟 腹腔攻毒小鼠肺臟

圖 3.2 不同攻毒途徑小鼠生存曲線gure3.2 Survival curves of mice infected PmCQ2 via different ways of challenge鼠肺部組織病理學(xué)觀察觀察小鼠肺部的 HE 染色切片發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，無論是自然自然感染途徑的小鼠肺部均出現(xiàn)了明顯的炎性病理變化。炎性病細(xì)胞核的中性粒細(xì)胞為主，同時伴有淋巴細(xì)胞滲出。此外，一部管發(fā)生壞死，肺泡結(jié)構(gòu)不完整。就感染途徑而言，相同劑量 PmC，滴鼻感染和腹腔感染造成的炎性病理變化較，而肌肉注射造成顯著性高于對照組。具體結(jié)果如圖 3.2。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2602189