【摘要】：蛋白質(zhì)飼料資源短缺一直是制約著我國飼料工業(yè)健康平穩(wěn)發(fā)展瓶頸問題之一。單細(xì)胞蛋白(single cell protein,SCP)在解決世界糧食與蛋白飼料短缺問題存在較大潛質(zhì)。經(jīng)多年研究,工業(yè)生產(chǎn)SCP在菌種選育、生產(chǎn)工藝、發(fā)酵原料等方面均取得了較大進(jìn)展,但市場上SCP飼料價格依然很高。SCP飼料成本仍居高不下,造成SCP飼料在飼料工業(yè)中一直未得到大量應(yīng)用。提高生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)菌株非蛋白氮(Non-protein nitrogen,簡稱NPN)利用效率和生長速度,是降低單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。本研究擬以試驗室保藏酵母菌篩選,獲得能以廉價碳源快速生長、NPN利用能力強(qiáng)、菌體蛋白產(chǎn)量高的酵母菌株作為誘變育種初發(fā)菌。經(jīng)紫外照射誘變和硫酸二乙酯誘變以及復(fù)合誘變的誘變育種方法,通過對突變菌落大小的初篩及液體發(fā)酵復(fù)篩,篩選獲得菌體蛋白產(chǎn)量較高的優(yōu)勢突變菌,并對其發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果如下:通過對14種酵母菌利用不同碳、氮源的研究,確定其最適碳、氮源,并依據(jù)14種酵母的生長潛力、菌體蛋白產(chǎn)量、NPN利用能力等進(jìn)行排名,綜合各指標(biāo)排名。篩選出了綜合性能較優(yōu)的釀酒酵母M(Saccharomyces cerevisiae strain YI59)和釀酒酵母N2(Saccharomyces cerevisiae isolate AA2)。將酵母菌M和N2作為出發(fā)菌,進(jìn)行紫外照射誘變和硫酸二乙酯誘變的單因素誘變以及交叉復(fù)合誘變。以葡萄糖、硫酸銨為唯一碳、氮源,依平板菌落大小與液體發(fā)酵菌體蛋白產(chǎn)量進(jìn)行初篩和復(fù)篩。發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌N2的最適紫外誘變照射時間為10s、11s;釀酒酵母菌M為12 s、13 s。硫酸二乙酯誘變酵母菌M和N2的最適濃度分別為1.1%和0.4%。通過突變菌的初篩和復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)突變菌菌體蛋白含量、菌體蛋白產(chǎn)量與突變菌菌落的大小間無直接關(guān)聯(lián)。因而不能僅依靠菌落大小篩選高產(chǎn)SCP酵母菌,必須經(jīng)液體發(fā)酵復(fù)篩檢測菌體蛋白產(chǎn)量。最終通過篩選得到了一株菌體蛋白產(chǎn)量較高的菌株MH12U5,菌體蛋白含量達(dá)到了0.27 g/L,較出發(fā)菌M的0.22 g/L提高了22.72%(P0.05)。對突變菌MH12U5的葡萄糖添加量、硫酸銨添加量、磷酸二氫鉀添加量及種子液接種量進(jìn)行單因素試驗及正交試驗優(yōu)化。結(jié)果表明,突變菌株MH12U5培養(yǎng)的最適組合為葡萄糖添加量為2.5%、硫酸銨添加量為1.5%、磷酸二氫鉀添加量為0.5%、最適發(fā)酵接種量為5%。因此,菌株的最適發(fā)酵條件為,培養(yǎng)培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、發(fā)酵時間為84h。發(fā)酵條件優(yōu)化后突變菌MH12U5菌體蛋白產(chǎn)量由0.27 g/L優(yōu)化提高到了0.56 g/L(P0.05)。本試驗通過酵母菌的篩選、誘變育種、發(fā)酵條件優(yōu)化,獲得一株能以硫酸銨為唯一氮源發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的酵母突變菌株MH12U5,能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白,極大的降低了發(fā)酵成本,為緩解我國蛋白質(zhì)飼料短缺提供了理論支持。
【圖文】：

2.5.2 生長曲線通過不同時間對 14 種酵母菌菌液進(jìn)行 OD600值進(jìn)行測定，獲得生長曲線見圖 2-1。編號 Number 名稱 nameH1 釀酒酵母 NL21 Saccharomyces cerevisiae strain NL21H2 熱帶假絲酵母 QD4.2 Candida tropicalis strain QD4.2H3 膠紅酵母 KYZYP14 Rhodotorula mucilaginosa strain KYZYP14C1 產(chǎn)朊假絲酵母 Candida pumilusC3 產(chǎn)朊假絲酵母 Candida pumilusSC 釀酒酵母 S288c Saccharomyces cerevisiae strain S288cP1 釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeB1 乙醇假絲酵母 35 Candida ethanolica isolate 35G1 乙醇假絲酵母 41 Candida ethanolica isolate 41G2 釀酒酵母 CBS:422 Saccharomyces cerevisiae culture-collection CBS:422R1 熱帶假絲酵母 Candida tropicalisR2 熱帶假絲酵母 Candida tropicalisN2 釀酒酵母 AA2 Saccharomyces cerevisiae isolate AA2M 釀酒酵母 YI59 Saccharomyces cerevisiae strain YI59

同 2.2.2.6 誘變酵母液體發(fā)酵復(fù)篩將 150 ml 誘變選擇液體培養(yǎng)基倒入 500 ml 三角瓶中，接種約 1.0*108個酵母菌，將瓶置于 30℃恒溫空氣浴搖床上，轉(zhuǎn)速為 180 r/min，培養(yǎng) 84 h。.7 菌體蛋白測定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析酵母菌中蛋白質(zhì)含量測定方法同 2.2.7.2；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法同 2.2.8.8 試驗結(jié)果.8.1 致死率計算.8.1.1 硫酸二乙酯致死率統(tǒng)計誘變前后菌落數(shù)，計算致死率，，得下圖
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S816

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本文編號：2602116