【摘要】：氨氣是豬舍內(nèi)常見的有害氣體,可通過口鼻吸入進(jìn)入豬肺,對豬的呼吸道健康造成影響。本課題組前期利用80ppm濃度氨氣分別刺激保育仔豬0 d(NC組)、4 d(D4組)、8 d(D8組)和12 d(D12組),發(fā)現(xiàn)氨氣刺激造成仔豬肺纖維化。本研究基于這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果,借助免疫組化、免疫熒光、Q-PCR和轉(zhuǎn)錄組分析等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步探索氨氣刺激造成仔豬肺纖維化病程變化的分子機(jī)制,研究結(jié)果可為解析氨氣刺激誘導(dǎo)的肺組織損傷提供理論依據(jù)。本研究的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.氨氣刺激不同時(shí)間仔豬肺纖維化程度的統(tǒng)計(jì)分析將肺的纖維化程度按照由輕到重劃分為F0-F3共四個(gè)等級,其中F0無纖維化,F3纖維化最嚴(yán)重。隨后對氨氣刺激不同時(shí)間的仔豬肺組織切片進(jìn)行纖維化程度的統(tǒng)計(jì)與分析,發(fā)現(xiàn)D4組主要是F2(44%)和F3(56%),D8和D12組主要是F1(45%,56%)和F2(44%,33%),說明氨氣刺激導(dǎo)致仔豬肺的纖維化,并且纖維化程度隨著刺激時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先加重后減緩的現(xiàn)象。2.氨氣刺激對仔豬肺泡上皮細(xì)胞的損傷分析為了進(jìn)一步探究氨氣刺激導(dǎo)致仔豬肺纖維化的分子機(jī)制,本研究首先檢測了氨氣刺激對仔豬肺泡上皮細(xì)胞的影響。通過免疫組化技術(shù),從蛋白水平上分別檢測了Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AECⅡ)和Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(AECⅠ)的標(biāo)記蛋白SFTPC和AQP5在氨氣刺激前后的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)AQP5在D4組表達(dá)下調(diào),而SFTPC在D4組明顯上調(diào),表明氨氣刺激引起了肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量的變化,推測AECⅠ可能是肺泡受損的靶細(xì)胞,而AECⅡ由于其干細(xì)胞特性,在肺泡上皮損傷后通過增殖分化對上皮進(jìn)行修復(fù)。3.上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可能參與氨氣刺激誘導(dǎo)的仔豬肺纖維化的發(fā)生使用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù),我們分別檢測了AECⅡ和肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白SFTPC和α-SMA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在D4組仔豬肺泡上皮中同時(shí)存在上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。進(jìn)一步借助免疫熒光/免疫組化技術(shù)分別對上皮間隙連接蛋白Cnx43、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白vimentin、成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白S100A4和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)Cnx43的表達(dá)在D4下調(diào),而其他細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的蛋白表達(dá)在D4組上調(diào)。以上結(jié)果說明氨氣刺激后仔豬肺組織出現(xiàn)了EMT現(xiàn)象,且EMT現(xiàn)象在D4組最明顯,其變化趨勢與纖維化的病程變化相一致,故推測EMT可能參與氨氣誘導(dǎo)的仔豬肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。4.氨氣刺激引起仔豬肺纖維化相關(guān)基因的表達(dá)變化本課題組前期對氨氣刺激不同時(shí)間的仔豬肺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)289個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),其中46個(gè)基因在D4組表達(dá)量達(dá)到峰值,其基因表達(dá)變化趨勢與肺纖維化病程變化基本一致。因此,我們推測這些基因在氨氣誘導(dǎo)的仔豬肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究通過對以上46個(gè)DEGs進(jìn)行進(jìn)一步功能注釋和分析,發(fā)現(xiàn)它們主要與肺泡上皮結(jié)構(gòu)和功能(BPIFA1,BPIFB1,BPIFB2,LBP,LTF,SCGB3A2,DMBT1,ATP6V1C2,CLDN10,SLC5A1,SLC5A8)、細(xì)胞外基質(zhì)生成與降解(MMP7,FGFBP1,CP,OLFM4,AGR2,DPEP1)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控(BHLHA15,RPL18,DPYS,SSPO,SLC28A3)以及炎癥(PI3,SAA1,PGLYRP1,CRISP3,C3,KEL,IGLVs,IGLC1,JCHAIN)等相關(guān),其中MMP7,BPIs,IGLVs,SAA1和PI3可能與肺纖維化和EMT密切相關(guān)。最后,我們利用Q-PCR技術(shù)從mRNA水平上檢測了纖維化相關(guān)基因MMP7,TGF-β1,COL1A1,CTGF,CDH1,AQP5,S100A4,SFTPC和ACTA2在氨氣刺激前后肺組織的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)TGF-β1在D4組(p0.05)和D8(p0.01)表達(dá)顯著上調(diào),COL1A1在D8組(p0.01)表達(dá)顯著上調(diào),而CTGF(p0.01),CDH1(p0.05),S100A4(p0.05)和ACTA2(p0.01)的表達(dá)則在D4組顯著下調(diào),AQP5和SFTPC在D8組(p0.01)表達(dá)顯著。結(jié)論:80ppm氨氣刺激導(dǎo)致仔豬肺纖維化,并且纖維化程度隨著刺激時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先加重后減緩的現(xiàn)象。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可能參與氨氣誘導(dǎo)的仔豬肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。
【圖文】：

圖 1-1 肺纖維化的發(fā)病機(jī)制（King et al 2011）。Fig.1-1 Proposed mechanisms of pulmonary fibrosis (King et al 2011).1.3.3 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與肺纖維化過去對纖維化肺中的 FB 的來源存在爭論，，普遍的觀點(diǎn)是來源于原始的間質(zhì)FB 的分化、循環(huán)中骨髓源細(xì)胞派生 FB 以及上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)分化（Pozharskaya etal 2009）。同樣 MF 的來源目前也存在三種理論：第一種理論是原來的纖維母細(xì)胞通過表達(dá)血小板中的血小板生長因子（PDGF）、上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor β1, TGF-β1）和腫瘤壞死因子（TNF-α）遷移到受損的位點(diǎn)，隨后分化成 MF。第二種理論認(rèn)為 MF 可能是受循環(huán)間質(zhì)細(xì)胞控制的，通過高表達(dá)上皮細(xì)胞趨化因子將這些細(xì)胞吸引到肺臟中去。而第三種假設(shè)最近引起了更多的注意，MF 是通過上皮細(xì)胞分化成的，上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞連接丟失，上皮細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白（如α-SMA、纖連蛋白等）轉(zhuǎn)化為 MF，

EMT 首先是破壞了上皮細(xì)胞之間的連接（如緊密連接、縫隙連接等），細(xì)胞間的連接減弱或消失導(dǎo)致基底膜的完整性遭到破壞，從而使得上皮細(xì)胞喪失極性。同時(shí)伴隨著間質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)的活化，獲得表達(dá)上皮和間質(zhì)標(biāo)志物的中間表型。這些中間型的細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，如 S100 鈣結(jié)合蛋白 A4（S100 calcium binding protein A4, S100A4）、波形蛋白（vimentin）和α-SMA（Samy et al 2014）。目前對 EMT 過程還存在爭議，EMT 過程是一個(gè)動態(tài)過程，要想準(zhǔn)確的鑒定 EMT 過程需要在體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察到上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，然后穿過基底膜進(jìn)入間質(zhì)的全過程，但是目前的技術(shù)還無法達(dá)到這個(gè)目標(biāo)。因此，肺泡上皮細(xì)胞黏附因子 E-cadherin、肺泡上皮細(xì)胞間隙連接蛋白 43（connexin43，Cnx43）、肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA 和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白vimentin 等多種 EMT 標(biāo)志蛋白的鑒定成為了目前 EMT 檢測普遍使用的方法和手段（Pain et al 2014, 易建華 2012）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2602092