【摘要】：奶牛子宮內(nèi)膜作為子宮的壁層具有促進(jìn)發(fā)情周期循環(huán)、孕育胎兒、內(nèi)分泌等作用,在病原微生物侵入子宮時(shí),奶牛子宮內(nèi)膜不僅作為物理性屏障抵御微生物入侵,還可通過激活子宮局部先天免疫反應(yīng)恢復(fù)自身穩(wěn)態(tài)。奶牛子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能交錯(cuò),導(dǎo)致在體情況下很難對(duì)妊娠、子宮內(nèi)膜炎等生理、病理過程的分子機(jī)制作出系統(tǒng)的闡明。雖然以原代細(xì)胞為模型進(jìn)行研究能夠最真實(shí)的接近在體情況,但是原代細(xì)胞仍存在耗時(shí)、費(fèi)力、個(gè)體差異大等缺點(diǎn)。因此,建立穩(wěn)定傳代的奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,為深入揭示奶牛子宮內(nèi)膜在發(fā)情周期、妊娠、子宮內(nèi)膜炎過程中的分子機(jī)制建立基礎(chǔ),對(duì)于奶牛子宮內(nèi)膜炎癥的防控、治療、提高奶牛的妊娠率具有重要意義。本試驗(yàn)通過將人端粒酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)轉(zhuǎn)入奶牛子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells,ESCs)和上皮細(xì)胞(endometrial epithelium cells,EECs)中,成功篩選構(gòu)建了永生化奶牛子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系和上皮細(xì)胞系,并通過檢測(cè)角蛋白(Keratin)、波形蛋白(Vimentin)、細(xì)胞生長曲線分析、端粒長度分析、核型分析、雌激素和孕酮刺激等方法對(duì)構(gòu)建的細(xì)胞系的功能進(jìn)行了檢測(cè),試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)通過0.25%的胰酶消化法、組織塊培養(yǎng)法獲得了ESCs和EECs。通過顯微鏡形態(tài)觀察和細(xì)胞免疫熒光的方法對(duì)分離得到的兩種細(xì)胞純度進(jìn)行了形態(tài)和細(xì)胞類型鑒定,鑒定結(jié)果顯示:ESCs形態(tài)呈梭形,貼壁生長。EECs呈典型的鋪路石樣、聚團(tuán)貼壁生長;奶牛ESCs波形蛋白表達(dá)為陽性、EECs角蛋白表達(dá)為陽性。證明成功獲得純度較高的ESCs和EECs。(2)將pCI-neo-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)ESCs中,經(jīng)過濃度為400μg/mL的新霉素(G418)篩選14 d后獲得ESCs陽性克隆株,擴(kuò)大培養(yǎng)后命名為TERT-ESCs,TERT-ESCs目前已傳至50代。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光鑒定,TERT-ESCs中hTERT表達(dá)為陽性;通過顯微鏡觀察,TERT-ESCs在傳代過程中形態(tài)仍為梭形,貼壁生長;CCK 8分析結(jié)果顯示TERT-ESCs的增殖活力良好;凋亡分析結(jié)果表明,和原代ESCs相比TERT-ESCs在傳至50代時(shí)凋亡率差異不顯著;血清依賴性分析結(jié)果顯示血清促進(jìn)TERT-ESCs增值呈濃度依賴性;核型分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了hTERT基因的奶牛ESCs在傳至50代時(shí),染色體數(shù)目保持正常;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示與原代ESCs相比50代TERT-ESCs正常表達(dá)類固醇激素受體;雌激素對(duì)TERT-ESCs促增殖作用呈濃度依賴性,低濃度的孕酮對(duì)TERT-ESCs具有促增殖作用,高濃度的孕酮具有抑制增殖作用;RT-qPCR分析結(jié)果顯示,TERT-ESCs在傳至30代、50代時(shí)端粒長度保持穩(wěn)定;以上結(jié)果表明hTERT基因可以促使TERT-ESCs的永生化。(3)將pCI-neo-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EECs,經(jīng)過濃度為300μg/mL的新霉素(G418)篩選14 d后獲得EECs陽性克隆株,擴(kuò)大培養(yǎng)后命名為TERT-EECs,TERT-EECs目前已傳至20代。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光鑒定,TERT-EECs中hTERT表達(dá)為陽性;傳代過程中,TERT-EECs波形蛋白仍呈陽性表達(dá);CCK 8分析結(jié)果顯示TERT-EECs仍保持良好的增殖活力;通過RT-PCR鑒定分析,TERT-EECs與原代EECs相比可正常表達(dá)類固醇激素受體;雌激素對(duì)TERT-EECs促增殖作用呈濃度依賴性,低濃度的孕酮對(duì)TERT-EECs具有促增殖作用,高濃度的孕酮具有抑制TERT-EECs增殖作用;血清依賴性分析結(jié)果顯示血清促進(jìn)TERT-EECs增值呈濃度依賴性;核型分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了hTERT的EECs在傳代過程中,染色體數(shù)目保持正常。綜上所述,本試驗(yàn)將pCI-neo-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)入奶牛ESCs和EECs成功篩選獲得了永生化奶牛子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系和上皮細(xì)胞系。并通過一系列檢測(cè)方法鑒定表明兩種細(xì)胞系可以在體外無限傳代且具有正常的生物學(xué)功能,證明所得細(xì)胞系可以用于后期的試驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2601459