【摘要】：犬細(xì)小病毒病(Canine Parvovirus disease,CPVD)是由犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的急性、烈性、致死性傳染病。該病1978年于美國首次發(fā)現(xiàn)并迅速在全球范圍內(nèi)傳染流行,臨床表現(xiàn)為出血性腸炎型和非化膿性心肌炎型。主要危害2-8月齡幼犬,具有發(fā)病急、病程短、傳染性強(qiáng)、死亡率高等特點(diǎn)。1982年我國首次報(bào)道該病,并迅速在全國范圍內(nèi)流行,是我國主要的犬類傳染病之一,嚴(yán)重影響我國養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Pilymerase Amplification,RPA)是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)由重組酶與引物結(jié)合形成的復(fù)合物在模板上尋找同源序列,定位后引發(fā)鏈交換反應(yīng),啟動(dòng)DNA的合成,對模板上的目的片段進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增,可在25℃-42℃的恒溫條件下,10-15分鐘即可快速完成目的基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可與側(cè)流層析試紙條、生物芯片、凝膠電泳等多種方法結(jié)合進(jìn)行檢測。該技術(shù)敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、操作簡便,是目前可用于現(xiàn)場即時(shí)診斷最方便快捷的核酸檢測方法。為建立一種快速、簡便檢測犬細(xì)小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,設(shè)計(jì)合成四組RPA引物,篩選得到最佳引物組。通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)條件。建立了犬細(xì)小病毒的基礎(chǔ)RPA檢測方法,并在此基礎(chǔ)上初步建立CPV的側(cè)流層析試紙條(LFD)-RPA檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所建立的RPA方法在38℃恒溫反應(yīng)15 min即可快速、特異性的檢測出犬細(xì)小病毒。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,以陽性質(zhì)粒pEASY-CPV-VP2為模板,基礎(chǔ)RPA和LFD-RPA的檢測限均為1×10~1拷貝/μL,敏感性比普通PCR方法高10倍。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,除犬細(xì)小病毒(BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等檢測均為陰性。用所建立的基礎(chǔ)RPA和LFD-RPA方法對75份CPV糞便疑似陽性臨床樣品進(jìn)行檢測,陽性檢出率為88%,明顯高于普通PCR的檢出率(80%)和膠體金的檢出率(76%)。本研究建立的犬細(xì)小病毒RPA檢測方法操作簡單,反應(yīng)靈敏,特異性高,適用于CPV的臨床快速檢測。
【圖文】：

圖 1 CPV 病毒模式圖（Tsao J et al. 1991）Fig. 1 Schematic diagram of CPV結(jié)構(gòu)和編碼蛋白組是 條自主復(fù)制的單股負(fù)鏈線性 DNA，約含有 532

CPV基因組分子結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.292

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本文編號(hào)：2601581