【摘要】：豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)又稱豬喘氣病、豬地方流行性肺炎,是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染引起的一種慢性、高度接觸性、以咳嗽和喘氣為主要癥狀的傳染病。該病廣泛分布于世界各地,流行率高達(dá)38%-100%。目前主要采取滅活疫苗免疫的方式防控。ELISA方法是臨床應(yīng)用最廣泛的Mhp抗體檢測(cè)方法,但現(xiàn)有的商品化IgG ELISA檢測(cè)試劑盒不能區(qū)分滅活疫苗產(chǎn)生的抗體和自然感染產(chǎn)生抗體。Mhp366蛋白是一個(gè)Mhp膜表面脂蛋白,編碼蛋白具有良好的抗原性。但該蛋白在體外培養(yǎng)的Mhp中表達(dá)量極低,不能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答;在自然感染豬的Mhp中刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的體液免疫應(yīng)答。本研究擬建立區(qū)分Mhp高免血清抗體與恢復(fù)期血清抗體鑒別診斷ELISA方法和Mhp陰性血清與恢復(fù)期血清鑒別診斷ELISA方法。1.Mhp366-N蛋白的原核表達(dá)與純化目的:原核表達(dá)純化Mhp366-N蛋白;方法:用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,以pGEX-6P-1-mhp366重組質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增含有能區(qū)分滅活疫苗抗體和和自然感染抗體的Mhp366蛋白68-88位氨基酸(~(68)QKENSQKNDVVNSQNKTEKTE~(88))區(qū)段的1-837位核苷酸序列,連接原核表達(dá)載體pET28a(+),轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中,經(jīng)終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo),再用Ni~(2+)親和層析柱純化,得到高純度的Mhp366蛋白。結(jié)果:重組Mhp366-N蛋白能以可溶和包涵體兩種形式表達(dá),可溶Mhp366-N蛋白的表達(dá)量可達(dá)到整個(gè)菌體蛋白的5%;經(jīng)Ni~(2+)親和層析柱純化后純度超過90%。結(jié)論:為后續(xù)ELISA檢測(cè)方法的建立提供了高純度的Mhp366-N蛋白。2.豬肺炎支原體高免血清抗體與恢復(fù)期血清抗體鑒別診斷ELISA方法的建立目的:建立Mhp高免血清抗體與恢復(fù)期血清抗體鑒別診斷ELISA方法。方法:確定Mhp高免血清抗體與恢復(fù)期血清抗體鑒別診斷ELISA方法的最佳反應(yīng)條件,包括最佳抗原包被濃度、最佳封閉液、最佳封閉時(shí)間、最佳血清稀釋度、最佳血清孵育時(shí)間、最佳二抗稀釋濃度、最佳二抗孵育時(shí)間、最佳顯色時(shí)間。確定了判定標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行了批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)、批間重復(fù)試驗(yàn)、特異性和靈敏性檢驗(yàn)。最后進(jìn)行了臨床樣品檢測(cè),并與其他試劑盒的結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果:確定抗原的最佳包被濃度為0.25μg/mL,最佳封閉液為2.5%脫脂奶粉,最佳封閉時(shí)間為0.5 h,最佳血清稀釋度為1:1 000,最佳血清孵育時(shí)間為0.5 h,最佳二抗工作濃度為1:10 000,最佳二抗孵育時(shí)間為2 h,最佳顯色時(shí)間為10 min。確定臨界值為0.319。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于7%。該方法具有良好的特異性和靈敏性。結(jié)論:建立了Mhp高免血清抗體與恢復(fù)期血清抗體鑒別診斷ELISA方法。3.豬肺炎支原體陰性血清與恢復(fù)期血清鑒別診斷ELISA方法的建立目的:建立Mhp陰性血清與恢復(fù)期血清鑒別診斷ELISA方法。方法:確定Mhp陰性血清與恢復(fù)期血清鑒別診斷ELISA方法的最佳反應(yīng)條件,包括最佳抗原包被濃度、最佳封閉液、最佳封閉時(shí)間、最佳血清稀釋度、最佳血清孵育時(shí)間、最佳二抗稀釋濃度、最佳二抗孵育時(shí)間、最佳顯色時(shí)間。確定了判定標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行了批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)、批間重復(fù)試驗(yàn)、特異性和靈敏性檢驗(yàn)。最后進(jìn)行了臨床樣品檢測(cè),并與其他試劑盒的結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果:確定抗原的最佳包被濃度為0.25μg/mL,最佳封閉液為2.5%脫脂奶粉,最佳封閉時(shí)間為1 h,最佳血清稀釋度為1:500,最佳血清孵育時(shí)間為0.5 h,最佳二抗工作濃度為1:10 000,最佳二抗孵育時(shí)間為2h,最佳顯色時(shí)間為15 min。確定臨界值為0.297。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)小于8%,批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)小于6%。該方法具有良好的特異性和靈敏性。結(jié)論:建立的了Mhp陰性血清與恢復(fù)期血清鑒別診斷ELISA方法。
【圖文】：

-1：mhp366-N 基因片段的 PCRDNAmarker；1: mhp366-N 基因片-1: PCR pruducts of mhp366-N sM: DNAmarker; 1: mhp366-N segmen-mhp366-N 的酶切鑒定Ⅰ和 Xho I 雙酶切后克隆入an+抗性篩選，獲得重組質(zhì)，，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖

質(zhì)粒 pET-28a(+)-mhp366-N 的：DL5000；1：pET-28a(+)-mhp366-binant plasmid pET-28a(+)-mhpBamH I and Xho I.M: DL5000; 1: pET-28a(+)-mhp366-Nmhp366-N 的測(cè)序結(jié)果 Ⅰ雙酶切驗(yàn)證的陽性重組組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，mh 菌株 mhp366 基因 1-837 位達(dá)形式的鑒定
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.28;S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 李石;李R

本文編號(hào)：2600954