發(fā)布時間：2020-03-26 00:19

【摘要】：鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動物附屬器官,對鹿茸進行基礎研究,不僅為研究器官再生提供了科學參考,也為實踐生產提供一定的科學理論基礎。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor,PEDF)具有抑制血管生成以及在骨的形成和骨化中扮演重要的作用。在鹿茸內,PEDF廣泛分布于鹿茸各個組織層中并涉及鹿茸中表皮、真皮、軟骨、骨、血管和神經的高速增殖與分化。然而,PEDF在鹿茸內促進鹿茸細胞增殖和分化的具體機制尚不清楚。因此,本課題以鹿茸細胞(間充質細胞、前成軟骨細胞、軟骨細胞)為研究對象,利用RNAi干擾等技術手段探討PEDF在鹿茸細胞生長發(fā)育過程中的作用及機制。主要研究結果如下:間充質細胞(mesenchyme,MSCs)、前成軟骨細胞(Pre-cartilage,QCs)和軟骨細胞(Cartilage,RCs)(1)PEDF受體LR干擾效果檢測:定量和Western blot結果顯示,與對照組相比,轉染組LR基因的mRNA和蛋白質表達量均顯著下調(p0.05),其中間充質細胞(mesenchyme,MSCs)下調68.02%,前成軟骨細胞(Pre-cartilage,QCs)下調93.3%,軟骨細胞(Cartilage,RCs)下調60.25%,說明siRNA干擾效果明顯(p0.05)。(2)PEDF調控了細胞周期:與對照組相比,干擾LR(siLR)組三種細胞S期均顯著下調(p0.05),PEDF處理組S期除MSCs外均顯著上調(p0.05);定量和Western blot結果顯示PEDF可顯著上調除MSCs外的鹿茸細胞內CyclinD1的表達(p0.05)。(3)PEDF促進鹿茸細胞的增殖:CCK-8的實驗結果顯示三種細胞中干擾LR(siLR)組,其細胞活力顯著下調(p0.05),PEDF處理組顯著均上調(p0.05)。定量和Western blot結果顯示PEDF可顯著上調鹿茸細胞中PCNA的表達(p0.05)。(4)PEDF上調血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達:從mRNA水平和蛋白水平VEGF的表達量情況,三種細胞內干擾LR(siLR)組VEGF的表達量均顯著下調(p0.05)。PEDF處理鹿茸細胞后,VEGF的表達量均顯著上調(p0.05)。(5)PEDF調控鹿茸細胞的生長通過ERK1/2信號通路:RCs中,WB結果顯示,干擾LR(siLR)組,ERK1/2的表達顯著下調(p0.05),但PEDF單獨處理則無顯著影響。MSCs中,干擾LR(siLR)組,ERK1/2的表達上調(p0.05),PEDF單獨處理后反而下調(p0.05)。QCs中,干擾LR(siLR)組,ERK1/2表達顯著下調(p0.05),PEDF單獨處理后ERK1/2表達顯著上調(p0.05)。本實驗結果表明:PEDF具有促進鹿茸細胞增殖和周期的作用,干擾PEDF在鹿茸中起主要作用的受體LR后,細胞的活力均顯著下調,周期均受到阻礙,并可顯著抑制VEGF的表達。在鹿茸生長發(fā)育過程中,PEDF可促進VEGF的表達進而調控血管生成。
【圖文】：

圖 1-1 鹿茸頂端增殖區(qū)各層細胞的分布位置 真皮層；P: 軟骨膜；M:間充質層；PC：前成軟骨層；骨層he location of each cells in the top proliferation area o: Dermis; P: Perichondrium; M: Reserve mesenchyme（M（QCs）; TZ: Transition zone; C: Cartilage（RCs）質層作為一種多功能干細胞，最初由 Friedenstein 和向分化成軟骨細胞和成骨細胞的能力(Friedens做了諸多研究，發(fā)現(xiàn)間充質細胞可從多種組織和臍帶血等，且都具有分化的潛能(Boyd et al 2國際細胞治療協(xié)會建議將分離卻未純化的貼壁

PEDF 對鹿茸不同細胞增殖的作用及機制研究驗結果 鹿茸細胞的鑒定將分層培養(yǎng)獲取并凍存的鹿茸細胞（MSCs，QCs，RCs）從液氮中取出，傳 2 代后分別用甲苯胺藍、茜素紅 S 和阿利新藍染色。鹿茸間充質細胞細現(xiàn)長梭形，甲苯胺藍染色無異染，細質和胞核染色后均呈現(xiàn)藍色；茜素紅細胞無陽性反應，阿利新藍染色胞質無藍染，只有細胞核藍染（如圖 a）骨與間充質細胞相比細胞體積較大，，呈長橢圓形，細胞核偏離細胞中央，染色部分細胞出現(xiàn)異染，茜素紅 S 染色胞質內有微弱陽性反應，阿利新藍出現(xiàn)藍染，胞核無藍染（如圖 b）。軟骨細胞細胞形態(tài)和核膜都不規(guī)則（，甲苯胺藍染色，胞質有紫紅色異染現(xiàn)象，茜素紅 S 染色有明顯的紅色鈣新藍染色，胞質胞核均被藍染（如圖 c）。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S825

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本文編號：2600648