【摘要】：鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動(dòng)物附屬器官,對(duì)鹿茸進(jìn)行基礎(chǔ)研究,不僅為研究器官再生提供了科學(xué)參考,也為實(shí)踐生產(chǎn)提供一定的科學(xué)理論基礎(chǔ)。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor,PEDF)具有抑制血管生成以及在骨的形成和骨化中扮演重要的作用。在鹿茸內(nèi),PEDF廣泛分布于鹿茸各個(gè)組織層中并涉及鹿茸中表皮、真皮、軟骨、骨、血管和神經(jīng)的高速增殖與分化。然而,PEDF在鹿茸內(nèi)促進(jìn)鹿茸細(xì)胞增殖和分化的具體機(jī)制尚不清楚。因此,本課題以鹿茸細(xì)胞(間充質(zhì)細(xì)胞、前成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞)為研究對(duì)象,利用RNAi干擾等技術(shù)手段探討PEDF在鹿茸細(xì)胞生長發(fā)育過程中的作用及機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchyme,MSCs)、前成軟骨細(xì)胞(Pre-cartilage,QCs)和軟骨細(xì)胞(Cartilage,RCs)(1)PEDF受體LR干擾效果檢測(cè):定量和Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組LR基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(p0.05),其中間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchyme,MSCs)下調(diào)68.02%,前成軟骨細(xì)胞(Pre-cartilage,QCs)下調(diào)93.3%,軟骨細(xì)胞(Cartilage,RCs)下調(diào)60.25%,說明siRNA干擾效果明顯(p0.05)。(2)PEDF調(diào)控了細(xì)胞周期:與對(duì)照組相比,干擾LR(siLR)組三種細(xì)胞S期均顯著下調(diào)(p0.05),PEDF處理組S期除MSCs外均顯著上調(diào)(p0.05);定量和Western blot結(jié)果顯示PEDF可顯著上調(diào)除MSCs外的鹿茸細(xì)胞內(nèi)CyclinD1的表達(dá)(p0.05)。(3)PEDF促進(jìn)鹿茸細(xì)胞的增殖:CCK-8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三種細(xì)胞中干擾LR(siLR)組,其細(xì)胞活力顯著下調(diào)(p0.05),PEDF處理組顯著均上調(diào)(p0.05)。定量和Western blot結(jié)果顯示PEDF可顯著上調(diào)鹿茸細(xì)胞中PCNA的表達(dá)(p0.05)。(4)PEDF上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá):從mRNA水平和蛋白水平VEGF的表達(dá)量情況,三種細(xì)胞內(nèi)干擾LR(siLR)組VEGF的表達(dá)量均顯著下調(diào)(p0.05)。PEDF處理鹿茸細(xì)胞后,VEGF的表達(dá)量均顯著上調(diào)(p0.05)。(5)PEDF調(diào)控鹿茸細(xì)胞的生長通過ERK1/2信號(hào)通路:RCs中,WB結(jié)果顯示,干擾LR(siLR)組,ERK1/2的表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05),但PEDF單獨(dú)處理則無顯著影響。MSCs中,干擾LR(siLR)組,ERK1/2的表達(dá)上調(diào)(p0.05),PEDF單獨(dú)處理后反而下調(diào)(p0.05)。QCs中,干擾LR(siLR)組,ERK1/2表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05),PEDF單獨(dú)處理后ERK1/2表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:PEDF具有促進(jìn)鹿茸細(xì)胞增殖和周期的作用,干擾PEDF在鹿茸中起主要作用的受體LR后,細(xì)胞的活力均顯著下調(diào),周期均受到阻礙,并可顯著抑制VEGF的表達(dá)。在鹿茸生長發(fā)育過程中,PEDF可促進(jìn)VEGF的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控血管生成。
【圖文】：

圖 1-1 鹿茸頂端增殖區(qū)各層細(xì)胞的分布位置 真皮層；P: 軟骨膜；M:間充質(zhì)層；PC：前成軟骨層；骨層he location of each cells in the top proliferation area o: Dermis; P: Perichondrium; M: Reserve mesenchyme（M（QCs）; TZ: Transition zone; C: Cartilage（RCs）質(zhì)層作為一種多功能干細(xì)胞，最初由 Friedenstein 和向分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力(Friedens做了諸多研究，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞可從多種組織和臍帶血等，且都具有分化的潛能(Boyd et al 2國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)建議將分離卻未純化的貼壁

PEDF 對(duì)鹿茸不同細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究驗(yàn)結(jié)果 鹿茸細(xì)胞的鑒定將分層培養(yǎng)獲取并凍存的鹿茸細(xì)胞（MSCs，QCs，RCs）從液氮中取出，傳 2 代后分別用甲苯胺藍(lán)、茜素紅 S 和阿利新藍(lán)染色。鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)現(xiàn)長梭形，甲苯胺藍(lán)染色無異染，細(xì)質(zhì)和胞核染色后均呈現(xiàn)藍(lán)色；茜素紅細(xì)胞無陽性反應(yīng)，阿利新藍(lán)染色胞質(zhì)無藍(lán)染，只有細(xì)胞核藍(lán)染（如圖 a）骨與間充質(zhì)細(xì)胞相比細(xì)胞體積較大，，呈長橢圓形，細(xì)胞核偏離細(xì)胞中央，染色部分細(xì)胞出現(xiàn)異染，茜素紅 S 染色胞質(zhì)內(nèi)有微弱陽性反應(yīng)，阿利新藍(lán)出現(xiàn)藍(lán)染，胞核無藍(lán)染（如圖 b）。軟骨細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和核膜都不規(guī)則（，甲苯胺藍(lán)染色，胞質(zhì)有紫紅色異染現(xiàn)象，茜素紅 S 染色有明顯的紅色鈣新藍(lán)染色，胞質(zhì)胞核均被藍(lán)染（如圖 c）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S825

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本文編號(hào)：2600648