【摘要】：抵抗素是一種炎性細胞因子,能夠參與機體的免疫調節(jié),與II型糖尿病和肥胖等多種疾病的發(fā)生有關。NLRs(NOD-like receptors),包括NOD1(Nucleotide-binding oligomerization domain 1)、NOD2、NLRP3等是天然免疫系統(tǒng)中的重要受體,可接受多種物質的調控,與多種免疫相關信號通路的激活有關。實驗室前期研究表明,抵抗素不影響RAW264.7細胞NOD1的表達,但能促進其NOD2的表達,活化NOD2-NF-κB信號通路并釋放IL-6、IL-18、TNF-α等炎性細胞因子,但NOD2并不是抵抗素作用的必需受體。NLRP3受NF-κB的調控并參與炎癥過程,是NLRP3炎性體的中心,但目前尚無抵抗素與NLRP3關聯(lián)的報道,抵抗素能否通過NF-κB信號通路活化NLRP3,啟動NLRP3炎性體的組裝,尚有待研究證明。因此,利用RAW264.7(小鼠單核巨噬細胞)研究抵抗素對其NLRP3基因和蛋白表達,以及活化NF-κB信號通路促進炎性細胞因子釋放的影響,明確抵抗素與NLRP3的作用機制。方法與結果:(1)用終濃度為50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7至預定時間(0h、3h、6h、12h、24h)。運用Real Time-PCR和Western Blot技術分別檢測細胞NLRP3、NF-κB的基因和蛋白表達水平,ELISA檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等細胞因子的濃度。結果表明,抵抗素上調RAW264.7中NLRP3及NF-κB基因和蛋白的表達;培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的含量隨抵抗素終濃度(50-200ng/mL)的增高及培養(yǎng)時間(0-24h)的延長而增加。(2)設計三條不同的siRNA沉默NLRP3基因,熒光顯微鏡下檢測轉染效率,Real Time PCR檢測沉默效果。結果發(fā)現(xiàn)在轉染效率較高的條件下,三條siRNA沉默效果均不好。隨后更換為用終濃度為10 nmol/L的MCC950(NLRP3的特異性抑制劑)預處理RAW264.7細胞0.5h,添加200 ng/mL的抵抗素繼續(xù)孵育24 h,檢測NLRP3及NF-κB的基因、蛋白表達變化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的濃度。結果:添加MCC950,RAW264.7細胞中NLRP3基因和蛋白表達水平較抵抗素組極顯著下調(P0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的濃度極顯著降低(P0.001)。表明NLRP3是抵抗素促進RAW264.7細胞釋放促炎細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的關鍵調控因子,但不影響抵抗素激活NF-κB的表達。(3)用終濃度為25μmol/L的小白菊內酯(NF-κB的特異性抑制劑)預處理RAW264.7細胞1h,添加200 ng/mL的抵抗素繼續(xù)孵育24 h,檢測NLRP3及NF-κB的蛋白表達變化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的濃度。結果:添加小白菊內酯,RAW264.7細胞中NLRP3和NF-κB蛋白濃度顯著降低(P0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的濃度顯著降低(P0.001)。表明NF-κB是抵抗素促進RAW264.7細胞NLRP3蛋白表達和促炎細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的釋放的必需因子。結論:(1)抵抗素促進RAW264.7細胞的NLRP3基因表達上調、蛋白表達增高,激活NF-κB并促進細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的釋放。(2)NLRP3參與抵抗素誘導RAW264.7細胞促炎細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的釋放過程,但其并非抵抗素激活NF-κB的必需因子。(3)NF-κB是抵抗素誘導NLRP3表達升高和RAW264.7釋放促炎細胞因子的關鍵調控因子之一。
【圖文】：

Low Density High Density圖 2-1 正常培養(yǎng)的 RAW264.7 細胞形態(tài)Fig 2-1 Normal cultured RAW264.7 cell morphology：左圖為對照組 RAW264.7 細胞低密度時形態(tài)；右圖為對照組 RAW264.7 細胞高密度時形倍數(shù)為 4×10。

20圖 2-2 不同處理下 48h 內細胞形態(tài)Fig 2-2 Cell morphology within 48h under different treatment注：上圖中，，A 組為對照組 RAW264.7 細胞，B 組為加入抵抗素孵育相應時間的 RAW264.7 細胞第 1 列為 0 h 時的細胞，即傳代后處于對數(shù)期生長態(tài)勢良好的細胞；第 2 列為不同組處理細胞 6時的細胞狀態(tài)；第 3 列為不同組處理細胞 12 h 時的細胞狀態(tài)；第 4 列為不同組處理細胞 24 h 時的細胞狀態(tài)；第 5 列為不同組處理細胞 48 h 時的細胞狀態(tài)。
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

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本文編號：2600690