【摘要】：抵抗素是一種炎性細(xì)胞因子,能夠參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié),與II型糖尿病和肥胖等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。NLRs(NOD-like receptors),包括NOD1(Nucleotide-binding oligomerization domain 1)、NOD2、NLRP3等是天然免疫系統(tǒng)中的重要受體,可接受多種物質(zhì)的調(diào)控,與多種免疫相關(guān)信號(hào)通路的激活有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,抵抗素不影響RAW264.7細(xì)胞NOD1的表達(dá),但能促進(jìn)其NOD2的表達(dá),活化NOD2-NF-κB信號(hào)通路并釋放IL-6、IL-18、TNF-α等炎性細(xì)胞因子,但NOD2并不是抵抗素作用的必需受體。NLRP3受NF-κB的調(diào)控并參與炎癥過(guò)程,是NLRP3炎性體的中心,但目前尚無(wú)抵抗素與NLRP3關(guān)聯(lián)的報(bào)道,抵抗素能否通過(guò)NF-κB信號(hào)通路活化NLRP3,啟動(dòng)NLRP3炎性體的組裝,尚有待研究證明。因此,利用RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞)研究抵抗素對(duì)其NLRP3基因和蛋白表達(dá),以及活化NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放的影響,明確抵抗素與NLRP3的作用機(jī)制。方法與結(jié)果:(1)用終濃度為50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7至預(yù)定時(shí)間(0h、3h、6h、12h、24h)。運(yùn)用Real Time-PCR和Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞NLRP3、NF-κB的基因和蛋白表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等細(xì)胞因子的濃度。結(jié)果表明,抵抗素上調(diào)RAW264.7中NLRP3及NF-κB基因和蛋白的表達(dá);培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的含量隨抵抗素終濃度(50-200ng/mL)的增高及培養(yǎng)時(shí)間(0-24h)的延長(zhǎng)而增加。(2)設(shè)計(jì)三條不同的siRNA沉默NLRP3基因,熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,Real Time PCR檢測(cè)沉默效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染效率較高的條件下,三條siRNA沉默效果均不好。隨后更換為用終濃度為10 nmol/L的MCC950(NLRP3的特異性抑制劑)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞0.5h,添加200 ng/mL的抵抗素繼續(xù)孵育24 h,檢測(cè)NLRP3及NF-κB的基因、蛋白表達(dá)變化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的濃度。結(jié)果:添加MCC950,RAW264.7細(xì)胞中NLRP3基因和蛋白表達(dá)水平較抵抗素組極顯著下調(diào)(P0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的濃度極顯著降低(P0.001)。表明NLRP3是抵抗素促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的關(guān)鍵調(diào)控因子,但不影響抵抗素激活NF-κB的表達(dá)。(3)用終濃度為25μmol/L的小白菊內(nèi)酯(NF-κB的特異性抑制劑)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h,添加200 ng/mL的抵抗素繼續(xù)孵育24 h,檢測(cè)NLRP3及NF-κB的蛋白表達(dá)變化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的濃度。結(jié)果:添加小白菊內(nèi)酯,RAW264.7細(xì)胞中NLRP3和NF-κB蛋白濃度顯著降低(P0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的濃度顯著降低(P0.001)。表明NF-κB是抵抗素促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)和促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的釋放的必需因子。結(jié)論:(1)抵抗素促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的NLRP3基因表達(dá)上調(diào)、蛋白表達(dá)增高,激活NF-κB并促進(jìn)細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的釋放。(2)NLRP3參與抵抗素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的釋放過(guò)程,但其并非抵抗素激活NF-κB的必需因子。(3)NF-κB是抵抗素誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)升高和RAW264.7釋放促炎細(xì)胞因子的關(guān)鍵調(diào)控因子之一。
【圖文】：

Low Density High Density圖 2-1 正常培養(yǎng)的 RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)Fig 2-1 Normal cultured RAW264.7 cell morphology：左圖為對(duì)照組 RAW264.7 細(xì)胞低密度時(shí)形態(tài)；右圖為對(duì)照組 RAW264.7 細(xì)胞高密度時(shí)形倍數(shù)為 4×10。

20圖 2-2 不同處理下 48h 內(nèi)細(xì)胞形態(tài)Fig 2-2 Cell morphology within 48h under different treatment注：上圖中，，A 組為對(duì)照組 RAW264.7 細(xì)胞，B 組為加入抵抗素孵育相應(yīng)時(shí)間的 RAW264.7 細(xì)胞第 1 列為 0 h 時(shí)的細(xì)胞，即傳代后處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好的細(xì)胞；第 2 列為不同組處理細(xì)胞 6時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)；第 3 列為不同組處理細(xì)胞 12 h 時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)；第 4 列為不同組處理細(xì)胞 24 h 時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)；第 5 列為不同組處理細(xì)胞 48 h 時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 金仲品;;抵抗素研究的進(jìn)展[J];濱州職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年01期

2 賈燕;王t

本文編號(hào)：2600690