【摘要】：大腸桿菌(Escherichia coli,Ecoli)是引起奶牛乳房炎的主要環(huán)境致病菌,導(dǎo)致乳腺組織損傷及細(xì)胞死亡。目前,抗生素是防治奶牛乳房炎的主要手段,但抗生素過(guò)度使用帶來(lái)嚴(yán)重的食品衛(wèi)生安全、抗生素耐藥性擴(kuò)散及環(huán)境污染問(wèn)題。益生菌作為潛在的抗生素替代品,在防治大腸桿菌性奶牛乳房炎方面具有重要作用。本研究使用大腸桿菌感染奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)體外模型,探究益生菌鼠李糖乳酸桿菌GR-1(Lactobacillus rhamnosusGR-1,LGR-1)減輕大腸桿菌引起的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)及細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。使用組織貼塊法及差速離心法,從健康奶牛乳腺分離得到純化的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞,cytokeratin18染色表明,BMECs具有明顯的上皮細(xì)胞特征。BMECs提前3h孵育LGR-1(1 × 107 CFU/ml),然后感染E.coli(1× 107CFU/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),活的及紫外滅活的LGR-1抑制了E.coli在BMECs黏附。E.coli感染后,Toll-like receptor 4(TLR4),NOD1及NOD2 mRNA表達(dá)明顯升高,然而預(yù)孵育LGR-1減弱了上述因子的高表達(dá)。免疫熒光及Western blot結(jié)果表明,預(yù)孵育LGR-1降低了E.coli引起的NLRP3(NOD-like receptor family member pyrin domain-containing protein 3)及caspase-1 高表達(dá)。然而,E.coli感染后,接頭蛋白ASC(apoptosis-associatedspeck-likeprotein)表達(dá)明顯降低。預(yù)孵育LGR-1抑制了E.coli引起的白介素interleukin(IL)1β、-6、-8、-18及腫瘤壞死因子α mRNA的高表達(dá),但上調(diào)了IL-10 mRNA表達(dá)。本部分結(jié)果表明,LGR-1降低了E.coli黏附,進(jìn)一步通過(guò)促進(jìn)TLR2表達(dá),抑制了TLR4,NOD1及NOD2的表達(dá)及減弱ASC非依賴性的NLRP3炎性體激活,減弱E.coli引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)損傷,并限制E.coli 引起的致死性炎性反應(yīng)。為了進(jìn)一步確定ASC蛋白在LGR-1抗 E.coli感染中的作用,使用clustered,regularly interspaced,short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)-9技術(shù)敲除奶牛乳腺上皮MAC-T細(xì)胞ASC基因。MAC-T細(xì)胞提前3 h孵育LGR-1(1 × 107 CFU/ml),然后感染E.coli(1 × 107CFU/ml)。Western blot結(jié)果表明,E.coli感染后,NLRP3及NLRC4的表達(dá)升高,預(yù)孵育LGR-1降低了E.coli引起的兩種受體的高表達(dá),在敲除ASC基因的細(xì)胞中也有這種變化。免疫熒光及Western blot結(jié)果表明,E.coli感染6 h,預(yù)孵育LGR-1降低了E.coli引起的caspase-1激活,在ASC敲除細(xì)胞中也能觀察到。LGR-1抑制了E.coli引起的caspase-4激活。ASC敲除降低了細(xì)胞中IL-1β及IL-18的表達(dá),但沒(méi)有完全阻止大腸桿菌引起的IL-1β及IL-18高表達(dá)及細(xì)胞焦亡,然而預(yù)孵育LGR-1抑制了這種增加。本研究表明,在E.coli感染中,LGR-1抑制了ASC依賴性的NLRP3及NLRC4炎性體激活,及下游IL-1β及IL-18的產(chǎn)生。LGR-1抑制了E.coli引起的細(xì)胞焦亡,部分是通過(guò)減弱ASC非依賴性的NLRC4及非經(jīng)典的caspase-4激活。本研究加深了對(duì)益生菌作用分子機(jī)制的理解,為益生菌防治奶牛乳腺致病菌感染提供了科學(xué)理論支撐。
【圖文】：

圖邋１－３邋ＭＰＥＣ邋對(duì)乳腺的損傷（引自邋Ｓｈｐｉｇｅｌ邋Ｎ？以邋ｇ／．，Ｑｐ／ｍｏ／ｉ邋／？Ｍ／ｃｒｏ辦／ｏ／＜９ｇｙ，邋２００８，邋１１：邋６０－６５）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋ＭＰＥＣ邋ｉｎｄｕｃｅ邋ｄａｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｇｌａｎｄ邋（Ｓｈｐｉｇｅｌ邋Ｎ．邋ｅｔ邋ａｌ．．邋Ｃｕｒｒｅｎｔ邋Ｏｐｉｎｉｏｎ邋ｉｎ邋Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．邋２００８．邋１１：逡逑６０－６５）逡逑４逡逑

２．２結(jié)果逡逑２．２．１乳腺組織切片觀察逡逑通過(guò)對(duì)健康奶牛與乳房炎發(fā)病奶牛乳腺病理圖片觀察（圖２－１），可見健康泌乳期奶牛乳腺逡逑組織間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，腺泡中乳樣分泌物充盈，乳脂含景高（可見脂滴）（圖２－１Ａ）；健康非泌乳逡逑期奶牛乳腺腺泡結(jié)構(gòu)較完整，腺泡中乳汁樣分泌物較少（圖２－１Ｂ）；臨床乳房炎癥狀較輕的奶牛逡逑乳腺腺泡組織較完整，腺泡內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖２－１Ｃ）；臨床乳房炎奶牛乳腺腺泡中有炎性細(xì)逡逑胞浸潤(rùn)，偶見乳腺腺泡間質(zhì)內(nèi)有淋巴細(xì)胞，腺泡中可見散在的嗜酸性粒細(xì)胞，，乳腺腺泡腔內(nèi)有深逡逑染的乳樣分泌物（圖２－１Ｄ）；嚴(yán)重臨床乳房炎的乳腺切片可見乳腺硬化，纖維結(jié)締組織增生，正逡逑常乳腺的腺泡組織消失，取而代之的是大景結(jié)締組織，整個(gè)組織呈現(xiàn)炎癥的后期病變，可見大景逡逑的淤血以及大景的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖２－１Ｅ）；有大f埛忠逗訟赴�，炎许嵏胞浸然e饕杉行藻義狹Ｏ赴土馨拖赴ㄍ跡玻保疲ｅ義稀觶保咤義賢跡玻蹦膛Ｈ橄僮櫓齲湃舊義轄】的膛Ｓ肴櫸墾諄疾∧膛５娜橄僮櫓釁ǎ矗埃埃劐澹�。Ａ和仾健康奶牛乳腺讬┋轻叕；Ｃ－Ｆ为奶牛葯螇ㄕ伡病牛乳腺讬┋轻叕。辶x希疲椋紓酰潁邋澹玻卞澹齲椋螅簦錚穡幔簦瑁錚歟錚紓椋沐澹牛觶幔歟酰幔簦椋錚鑠澹錚駑澹恚幔恚恚幔潁澹裕椋螅螅酰澹簀義希齲椋螅簦錚穡幔簦瑁錚歟錚紓椋沐澹螅澹悖簦椋錚睿簀澹錚駑澹恚幔恚恚幔潁澹簦椋螅螅酰澹簀澹ǎ齲

本文編號(hào)：2600525