【摘要】：骨骼肌是畜禽肉類食品的重要組成部分,其肌纖維類型組成是影響肉品質(zhì)的重要因素。因此,研究骨骼肌發(fā)育對(duì)于如何提高肉產(chǎn)量以及改善肉品質(zhì)具有一定的指導(dǎo)意義。至今,有關(guān)骨骼肌形成過(guò)程的研究已有大量的報(bào)道。骨骼肌發(fā)育始于胚胎期,由中胚層的體節(jié)遷移出Pax3~+/Pax7~+肌源性祖細(xì)胞,由生肌調(diào)節(jié)因子Myf5、MyoD以及MRF4參與調(diào)控的成肌定向分化,肌細(xì)胞進(jìn)一步經(jīng)過(guò)增殖、分化融合形成肌纖維;在出生后,肌纖維數(shù)目基本確定,肌肉量的增加主要依賴肌纖維的增長(zhǎng)和增粗。當(dāng)骨骼肌受到損傷刺激或者運(yùn)動(dòng)時(shí),骨骼肌具備再生修復(fù)能力,而這種能力主要依靠肌源性干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞,Pax7~+/Myf5~-)的激活,激活后的衛(wèi)星細(xì)胞(Pax7~+/Myf5~+)可以向成肌進(jìn)行分化,融合形成新的肌纖維,達(dá)到修復(fù)受傷肌纖維的目的。無(wú)論是胚胎階段的骨骼肌形成,還是出生后骨骼肌的生長(zhǎng)甚至損傷后的再生修復(fù)過(guò)程,除受到Pax3/Pax7,MRFs的調(diào)控外,還受到MEF2家族成員,Wnt等信號(hào)分子,IGFs等生長(zhǎng)因子以及非編碼RNA的調(diào)控。近年來(lái),有關(guān)非編碼RNA調(diào)控骨骼肌的發(fā)育的研究備受關(guān)注,其重要性不容忽視。本論文的研究重點(diǎn)在于運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)篩選秦川牛不同發(fā)育階段(胚胎期、出生期以及成年階段)骨骼肌差異表達(dá)的非編碼RNA(lncRNAs和miRNAs),通過(guò)5’RACE和3’RACE、RT-qPCR、FISH、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)、RNA pull down、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù),系統(tǒng)闡釋源于生長(zhǎng)因子IGF2基因內(nèi)含子區(qū)域的非編碼RNA IGF2 AS和miR-483在牛骨骼肌發(fā)育中的功能和分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1、肌肉組織中l(wèi)ncRNAs的篩選、鑒定及表達(dá)特征分析本研究在實(shí)驗(yàn)室前期秦川牛不同發(fā)育階段(胚胎期、出生后和成年階段)骨骼肌lncRNA高通量測(cè)序的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步對(duì)已篩選的401個(gè)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行挖掘鑒定分析。發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)因子IGF2基因內(nèi)含子區(qū)域存在一個(gè)反義轉(zhuǎn)錄本,將其命名為IGF2 antisense transcript(IGF2 AS)。通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE),發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)錄本由698個(gè)核苷酸的單外顯子組成。經(jīng)蛋白編碼潛能軟件CPC預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),IGF2AS的編碼能力較弱,屬于非編碼RNA。高通量測(cè)序結(jié)果和RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果都證實(shí),IGF2 AS主要在胚胎階段的骨骼肌中表達(dá)。在牛骨骼肌細(xì)胞生長(zhǎng)階段,IGF2 AS表達(dá)量相對(duì)較高;在分化時(shí)期,IGF2 AS的表達(dá)呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。2、IGF2 AS調(diào)控牛骨骼肌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的功能研究運(yùn)用RT-qPCR、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)、EdU、CCK8、RNA-seq、細(xì)胞免疫熒光等試驗(yàn)揭示IGF2 AS在牛骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的功能。在牛骨骼肌細(xì)胞增殖階段,干擾IGF2 AS表達(dá)抑制細(xì)胞增殖關(guān)鍵基因的表達(dá)水平,導(dǎo)致G_1期細(xì)胞數(shù)目增加,S期細(xì)胞減少,細(xì)胞增殖活性下降,而過(guò)表達(dá)IGF2 AS后結(jié)果與之相反;在牛骨骼肌細(xì)胞分化階段,干擾IGF2 AS抑制生肌調(diào)控因子的表達(dá)水平,MyHC陽(yáng)性肌管的數(shù)目減少,而過(guò)表達(dá)IGF2 AS后結(jié)果與之相反;另外,干擾IGF2 AS導(dǎo)致牛骨骼肌細(xì)胞生長(zhǎng)階段凋亡細(xì)胞數(shù)目的增加,而過(guò)表達(dá)IGF2 AS抑制牛骨骼肌細(xì)胞的凋亡。3、IGF2 AS調(diào)控牛骨骼肌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的機(jī)制研究RNA核質(zhì)分離和熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IGF2 AS在牛骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都表達(dá)。經(jīng)DNaseⅠ和RNase A處理細(xì)胞總RNA后,PCR檢測(cè)結(jié)果表明IGF2AS與IGF2 mRNA的前體序列可形成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)。放線菌素D處理生長(zhǎng)階段的牛骨骼肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn),IGF2 AS的表達(dá)能夠穩(wěn)定IGF2不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。RIP分析結(jié)果表明,Ago-2蛋白質(zhì)可與IGF2 AS結(jié)合,推測(cè)IGF2 AS具有競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA的潛質(zhì)。雙熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果表明,miR-221/miR-222與IGF2 AS存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合關(guān)系,進(jìn)一步的功能驗(yàn)證結(jié)果表明過(guò)表達(dá)IGF2 AS能夠恢復(fù)miR-221/miR-222靶基因MyoD的表達(dá)。RNA pull down、蛋白質(zhì)譜以及RIP檢測(cè)結(jié)果表明,蛋白質(zhì)ILF3可與IGF2 AS結(jié)合。IGF2AS正調(diào)控ILF3的表達(dá),干擾ILF3后抑制牛骨骼肌細(xì)胞增殖和分化,促進(jìn)牛骨骼肌細(xì)胞凋亡。4、miR-483通過(guò)IGF1/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控牛骨骼肌細(xì)胞增殖和分化MicroRNA高通量測(cè)序分析結(jié)果表明,位于IGF2基因內(nèi)含子區(qū)域的miR-483在不同發(fā)育階段的骨骼肌中差異表達(dá),且在胚胎期表達(dá)量較高。功能研究結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)miR-483抑制牛骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化,干擾miR-483促進(jìn)牛骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化。機(jī)制研究表明,IGF1是miR-483的一個(gè)靶基因,并且miR-483可以通過(guò)下調(diào)IGF1的表達(dá),影響PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。本研究借助高通量測(cè)序技術(shù)篩選差異表達(dá)的lncRNA和microRNA,闡明lncRNA和microRNA在牛骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的功能和作用機(jī)制,為研究非編碼RNA調(diào)控牛骨骼肌發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

Shh、BMP 和 Notch 等，以及生長(zhǎng)因子 TGF-β、FGFs 和 IGFs 等的影響。另外，非編碼 RNA（miRNA 和 lncRNA）也廣泛參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育過(guò)程。出生后，肌肉量的增加主要依賴于骨骼肌纖維的增長(zhǎng)和增粗，這得益于肌源性干細(xì)胞（衛(wèi)星細(xì)胞）的存在。骨骼肌是可以再生的，這種能力正是由衛(wèi)星細(xì)胞所賦予的在正常狀態(tài)下，衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，當(dāng)骨骼肌運(yùn)動(dòng)或受到損傷刺激時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞由靜息狀態(tài)變成激活狀態(tài)，定向分化成成肌細(xì)胞，經(jīng)過(guò)增殖、分化融合形成肌管修復(fù)受傷的肌纖維，從而達(dá)到修復(fù)損傷骨骼肌的目的。整個(gè)過(guò)程也受到上述 Pax3/Pax7、MRFs、MEF2、信號(hào)分子、生長(zhǎng)因子以及非編碼 RNA 等因素的調(diào)控。骨骼肌損傷再生修復(fù)過(guò)程類似于胚胎階段骨骼肌發(fā)育，這為在體研究骨骼肌發(fā)育過(guò)程提供了有利條件1.1.1 生肌調(diào)控因子在骨骼肌形成過(guò)程中的作用生肌調(diào)控因子（MRFs）由 MyoD、Myf5、myogenin 和 MRF4 四個(gè)成員組成，都具備基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性（圖 1-1）。在胚胎階段骨骼肌生成和出生后骨骼肌發(fā)育的過(guò)程中，MRFs 參與調(diào)控骨骼肌的定向和分化(Hernandez-Hernandez et al. 2017)。通過(guò)調(diào)節(jié)肌節(jié)和肌肉特異性基因的活化以促進(jìn)細(xì)胞分化和肌節(jié)的組裝，它們?cè)诙鄠�(gè)點(diǎn)起協(xié)同作用以建立骨骼肌表型。

第一章 動(dòng)物骨骼肌發(fā)育及其非編碼 RNA 調(diào)控研究進(jìn)展in 下調(diào)，說(shuō)明在分化過(guò)程中 myogenin 作為重要的細(xì)胞周期退出調(diào)節(jié)因MyoD 能夠促進(jìn)生長(zhǎng)成肌細(xì)胞的增殖(Cao et al. 2006)。在 C2C12 成肌eq 實(shí)驗(yàn)證明，MyoD 和 Myf5 之間的差異依賴于轉(zhuǎn)錄活性而不是整個(gè)基點(diǎn)的偏好，只有 MyoD 能夠富集 RNA polⅡ并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，而 M蛋白 H4 乙�；揎椚旧w卻不能富集 RNA polⅡ，從而造成二者在調(diào)( Hernandez-Hernandez et al. 2017; Cao et al. 2010)。由此可見(jiàn)，MRFs 調(diào)僅有來(lái)自上游調(diào)控因子的參與，，其涉及調(diào)控的下游靶基因更是復(fù)雜多樣
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823

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1 宋成創(chuàng);IGF2基因來(lái)源的IGF2 AS和miR-483調(diào)控牛骨骼肌細(xì)胞增殖分化機(jī)制研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2600495