發(fā)布時(shí)間：2020-03-25 20:10

【摘要】：番鴨作為國(guó)內(nèi)外優(yōu)良的肉用鴨種之一,其具有生長(zhǎng)快、易飼養(yǎng)、抗病性強(qiáng)、產(chǎn)肉率高且具有特殊珍禽野味、產(chǎn)肥肝性能好、飼料報(bào)酬高等諸多優(yōu)點(diǎn)而深受廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的青睞,市場(chǎng)飼養(yǎng)前景較好。而相較于家鴨,母番鴨育成時(shí)間長(zhǎng)、年產(chǎn)蛋量低、就巢性強(qiáng)等缺點(diǎn)導(dǎo)致其繁殖性能較低,且飼養(yǎng)成本增加,嚴(yán)重制約了番鴨集約化、規(guī)�；曫B(yǎng)的發(fā)展。番鴨的繁殖性能的選種、選育迫在眉睫,而常規(guī)育種手段很難對(duì)繁殖性能做出精確選擇,而分子標(biāo)記育種技術(shù)可精確快速的輔助選種選育。尋找與番鴨繁殖性狀相關(guān)候選基因作遺傳分析,找出相關(guān)分子標(biāo)記,為番鴨繁殖性狀的選種選育提供分子依據(jù),本實(shí)驗(yàn)以番鴨為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,選取番鴨繁殖性能候選基因NPY、SMAD3兩個(gè)基因,克隆獲得NPY、SMAD3兩個(gè)基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)后進(jìn)行其同源性以及遺傳進(jìn)化關(guān)系等生物信息學(xué)分析;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分析NPY、SMAD3基因在產(chǎn)蛋期不同組織中的分布規(guī)律;對(duì)NPY、SMAD3兩個(gè)基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩查,并分析了這些多態(tài)位點(diǎn)與番鴨產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性。結(jié)果如下:1.成功克隆了番鴨NPY基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)294 bp,共編碼97個(gè)氨基酸,同源性對(duì)比顯示,NPY基因核苷酸序列與綠頭鴨同源性最高,為99.7%,其次是火雞,同源性為97.3%;NPY蛋白氨基酸序列與綠頭鴨、火雞相似性一致,同源性為100%,其次是原雞(99%),表明NPY基因在以上鳥(niǎo)類中具有較高的保守性;遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明番鴨與綠頭鴨的親緣關(guān)系最近;NPY蛋白特征分析結(jié)果表明,NPY蛋白為酸性且不穩(wěn)定,存在一個(gè)信號(hào)肽(第1位氨基酸至第28位氨基酸),細(xì)胞亞定位為100%位于細(xì)胞外;存在1個(gè)PAH的功能結(jié)構(gòu)域,同時(shí)含有2個(gè)O-糖基化以及豐富的磷酸化位點(diǎn),空間結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占優(yōu),該結(jié)果可為深入研究番鴨NPY基因的結(jié)構(gòu)與功能提供一定的參考資料。2.成功克隆獲得了番鴨SMAD3基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)966 bp,編碼321個(gè)氨基酸,同源性對(duì)比顯示,番鴨SMAD3基因CDS區(qū)核苷酸序列與綠頭鴨同源性最高,為99.8%,其次是鴻雁,同源性為99%;除美洲雕外,番鴨SMAD3基因氨基酸序列與綠頭鴨等鳥(niǎo)類的同源性為100%,氨基酸相似性完全匹配;與長(zhǎng)江江豚等哺乳動(dòng)物以及斑馬魚(yú)的同源性均為96.6%以上,表明NPY基因在以上物種中具有較高的保守性,遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明番鴨與綠頭鴨的親緣關(guān)系最近;SMAD3蛋白特征分析結(jié)果表明,SMAD3蛋白為酸性且不穩(wěn)定,無(wú)信號(hào)肽,細(xì)胞亞定位主要位于細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器內(nèi);存在MH1、MH2兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,同時(shí)富含糖基化和磷酸化位點(diǎn),空間結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲占優(yōu),該結(jié)果可為深入研究番鴨SMAD3基因的結(jié)構(gòu)與功能提供一定的參考資料。3.Q-PCR結(jié)果表明,NPY基因mRNA在番鴨各組織中均有表達(dá),其中在大腦中表達(dá)水平相對(duì)較高,胰腺、腺胃表達(dá)量次之,差異極顯著(P0.01),肌胃中表達(dá)量最低。SMAD3基因mRNA在各組織中均有分布,其中在肌肉組織中相對(duì)表達(dá)水平較高,子宮表達(dá)量次之,差異極顯著(P0.01),肌胃中表達(dá)量最低。4.在NPY基因的5’端啟動(dòng)子區(qū)中發(fā)現(xiàn)位于A-411G、A-540G的2個(gè)SNPs位點(diǎn),存在AA、AG、GG三種基因型,與產(chǎn)蛋性能相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),AG型番鴨群體開(kāi)產(chǎn)早于AA、GG基因型群體,差異極顯著(P0.01),GG基因型群體的開(kāi)產(chǎn)蛋重顯著高于AA基因型群體(P0.05),AG基因型群體300日齡總產(chǎn)蛋量顯著高于AA基因型群體(P0.05)。結(jié)果表明,在A-411G、A-540G兩個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)突變基因型可能是潛在的番鴨繁殖性能的分子標(biāo)記。5.在番鴨SMAD3基因的外顯子序列中共發(fā)現(xiàn)15個(gè)SNPs突變位點(diǎn),與產(chǎn)蛋性能相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),A+6185G位點(diǎn)的AA基因型、G+6269T位點(diǎn)的AA基因型、C+24204T位點(diǎn)的CC基因型、A+27515G位點(diǎn)的AG基因型與開(kāi)產(chǎn)日齡呈極顯著相關(guān)(P0.01或P0.05),C+24204T位點(diǎn)的CC基因型、A+27515G位點(diǎn)的AG基因型、A+27541G位點(diǎn)的AG基因型與300日齡總產(chǎn)蛋量呈極顯著或顯著相關(guān)(P0.01或P0.05),C+27350G突變位點(diǎn)中的CG基因型群體平均開(kāi)產(chǎn)蛋重顯著高于GG基因型(P0.05),C+24295T突變位點(diǎn)中,TT基因型開(kāi)產(chǎn)蛋重顯著高于CT基因型群體(P0.05),C+27535T突變位點(diǎn)中,CC基因型群體的開(kāi)產(chǎn)蛋重顯著高于CT基因型群體(P0.05)。表明上述SNPs突變位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型可能是番鴨繁殖性能的潛在分子標(biāo)記,可用于提高番鴨產(chǎn)蛋性能的分子標(biāo)記輔助選擇。
【圖文】：

18S 條帶明亮、清晰，且 28S 條帶亮度約為 18S 條帶的兩倍，說(shuō)明所抽提的組織總 RNA 結(jié)構(gòu)比較完整，質(zhì)量較好，未發(fā)生明顯的降解，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。圖.2-1 番鴨不同組織總 RNA 電泳檢測(cè)Fig.2-1 Detection of total RNA extracted from different tissues of Muscovy Duck3.2 番鴨 NPY 基因 CDS 區(qū)克隆番鴨組織樣混合 cDNA 經(jīng) NPY 克隆引物 PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)了大約為 294 bp 的目的片段(如圖 2-2 A），切膠回收后克隆于 pEASY-T5 Zero Cloning Kit 載體上，經(jīng)菌液 PCR 篩選陽(yáng)性菌液(如圖 2-2 B)，測(cè)序后獲得長(zhǎng)度為 294 bp 的開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame,ORF），包括起

(A) (B)圖 2-2 NPY 基因 CDS 區(qū) PCR 擴(kuò)增（A）與陽(yáng)性質(zhì)粒鑒定（B）；M.MarkerFig.2-2 PCR amplification of CDS region of NPY gene (A) and identification of NPY gene posplasmid (B).3.3 番鴨 SMAD3 基因 CDS 區(qū)克隆番鴨組織樣混合 cDNA 經(jīng) SMAD3 分段引物 PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng) 1.5%的瓊凝膠電泳檢測(cè)，分別出現(xiàn)了大約為 634bp、524 bp 的目的片段(如圖 2-3 A/切膠回收后克隆于 pEASY-T5 Zero Cloning Kit 載體上，經(jīng)菌液 PCR 擴(kuò)增后檢測(cè)挑選陽(yáng)性菌液(如圖 2-3 C/D)，陽(yáng)性菌液測(cè)序拼接后獲得片段長(zhǎng)度為 96的開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），包括起始密碼子 ATG，終止子 TAA，且該片段與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中 Genbank 上所公布的綠頭野鴨 SMAD3 基mRNA 序列（登錄號(hào)：XM_005030067.3）大小一致，表明克隆獲得的目的片SMAD3 基因完整的 CDS 區(qū)序列。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S834.2

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本文編號(hào)：2600384