【摘要】：萊姆病(Lyme disease)是由媒介蜱傳播的伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi sensu lato)感染所引起的一種自然疫源性疾病,是由蟲媒介蜱傳播的人獸共患病,該病發(fā)生和流行的時(shí)間與蜱蟲活躍時(shí)間一致。萊姆病對(duì)人類、動(dòng)物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的危害,主要波及野生動(dòng)物及寵物的健康養(yǎng)殖,已成為全球嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題。1986年,自艾承緒等首次在黑龍江省海林縣發(fā)現(xiàn)本病以來(lái),我國(guó)目前已有30個(gè)省(市、區(qū))經(jīng)確認(rèn)為萊姆病自然疫源地,主要分布在華北、西北和東北林區(qū),分布呈現(xiàn)地域聚集的趨勢(shì),該病的發(fā)生依賴于其媒介蜱以及宿主動(dòng)物的分布,但由于蜱蟲叮咬時(shí)無(wú)痛感,且該病的早期癥狀不明顯,常與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病、發(fā)燒等現(xiàn)象混淆導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間。早在1993年,于美國(guó)紐約25個(gè)城鎮(zhèn)采集的1446份犬血液樣本中,犬萊姆病陽(yáng)性率介于6.5%至85.2%之間。該數(shù)據(jù)表明由于人類與寵物犬關(guān)系密切,導(dǎo)致人感染萊姆病的機(jī)率增加。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展與人民生活水平的提高,寵物逐漸成為了人們生活中不可或缺的一部分。然而,我國(guó)對(duì)于犬萊姆病的血清學(xué)檢測(cè)方法尚未報(bào)道,因此建立快速準(zhǔn)確的犬萊姆病診斷方法迫在眉睫。本研究在國(guó)家十三五重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目“寵物細(xì)菌與真菌傳染病診療與防控新技術(shù)研究”(項(xiàng)目編號(hào):2016YFD0501005)支持下,建立伯氏疏螺旋體SYBR Green I熒光定量PCR方法和犬萊姆病間接ELISA診斷方法,為寵物與人類的健康安全提供技術(shù)支持與保障。主要研究?jī)?nèi)容如下:I.伯氏疏螺旋體SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立本研究基于國(guó)內(nèi)外主要流行的伯氏疏螺旋體菌株的3個(gè)基因型:嘎氏疏螺旋體(B.garinii)、阿氏疏螺旋體(B.afzelii)、狹義伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi sensu stricto)中的16S rRNA基因片段為模板,針對(duì)伯氏疏螺旋體的保守區(qū)域設(shè)計(jì)Real-time PCR特異性引物,建立熒光定量方法。其中該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)系數(shù)R~2為0.99,擴(kuò)增效率為98.217%。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明,所建立的方法只特異的檢測(cè)出伯氏疏螺旋體,而與其它病原無(wú)交叉反應(yīng)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明此方法比普通PCR靈敏10~4倍,能夠檢測(cè)到的最小拷貝數(shù)為4.72 copies/μL。應(yīng)用該方法對(duì)采自吉林省四平市的25只蜱蟲樣本進(jìn)行檢測(cè),樣品陽(yáng)性率為40.00%。II.伯氏疏螺旋體OspC的克隆表達(dá)及抗原性分析選取伯氏疏螺旋體外膜蛋白C(OspC),經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析,利用原核表達(dá)載體對(duì)B31菌株的OspC基因進(jìn)行表達(dá)、純化和Western-blot分析,表明該蛋白具有良好的免疫原性。III.犬萊姆病間接ELISA診斷方法的建立與應(yīng)用本研究建立了一種用于犬萊姆病診斷和血清流行病學(xué)調(diào)查的ELISA方法。以O(shè)spC蛋白為包被抗原,建立了用于犬萊姆病抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。應(yīng)用該方法對(duì)所采集到的309份犬血清臨床樣品進(jìn)行應(yīng)用檢測(cè),平均抗體陽(yáng)性率達(dá)20.71%。結(jié)果表明本研究所建立的ELISA方法可用于臨床血清樣本的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明萊姆病在我國(guó)的犬群中感染率較高。
【圖文】：

圖 1.1 PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1.1 PCR amplification electrophoresisM：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-3 16S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物M：2000bp DNA Marker；1-3：PCR products of 16S rRNA質(zhì)粒 PCR 鑒定5.2 方法，對(duì)重組菌進(jìn)行 PCR 鑒定，目的片段為 13片段克隆入 pEASY-T1 連接載體，測(cè)序結(jié)果顯示 T

圖 1.1 PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1.1 PCR amplification electrophoresisM：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-3 16S rRNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物：2000bp DNA Marker；1-3：PCR products of 16S rRN粒 PCR 鑒定 方法，對(duì)重組菌進(jìn)行 PCR 鑒定，，目的片段為 段克隆入 pEASY-T1 連接載體，測(cè)序結(jié)果顯示
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.292

【參考文獻(xiàn)】

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3 寶福凱;柳愛(ài)華;;伯氏疏螺旋體與萊姆病研究進(jìn)展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2007年11期

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1 于東冬;萊姆病分子生物學(xué)和診斷新技術(shù)的研究[D];吉林大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：2600344