【摘要】：貝氏隱孢子蟲(Cryptosporidium baileyi)是禽類的優(yōu)勢(shì)蟲種,主要寄生于宿主的喉頭、氣管、法氏囊、泄殖腔等部位,可引起呼吸系統(tǒng)疾病,給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而,目前還沒(méi)有用于C.baileyi的有效預(yù)防措施和治療藥物。近年的研究表明,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)可以參與宿主與病原相互作用過(guò)程,調(diào)節(jié)宿主抗病毒、細(xì)菌和寄生原蟲的免疫效應(yīng),特別是長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,并且還可作為多種疾病診斷和預(yù)后的有效生物標(biāo)志�；诖�,本研究以C.baileyi感染雛雞為模型,首次研究了與C.baileyi感染相關(guān)的宿主lncRNA、mRNA和circRNA表達(dá)譜。1.成功建立了C.baileyi感染雛雞模型:雛雞正常飼養(yǎng)3 d后,經(jīng)口感染1×10~6 C.baileyi卵囊,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在感染后5 d至29 d的糞便樣品以及感染后2 d到27 d的氣管組織樣品存在卵囊,序列分析發(fā)現(xiàn)這些卵囊均為C.baileyi。排卵囊規(guī)律研究顯示,排卵囊高峰出現(xiàn)于感染后10 d和16 d,并且以感染后10 d卵囊數(shù)量最多。感染后10 d的氣管組織經(jīng)HE染色和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組氣管中存在卵囊感染,而對(duì)照組雛雞氣管組織中未發(fā)現(xiàn)蟲體。2.獲得了C.baileyi感染雛雞的lncRNA與mRNA的表達(dá)譜:取感染C.baileyi 10 d的雛雞氣管,提取RNA,進(jìn)行l(wèi)ncRNA和mRNA測(cè)序,共獲得559 574 746個(gè)raw reads,過(guò)濾掉低質(zhì)量序列后剩余545 479 934個(gè)clean reads。經(jīng)過(guò)篩選,最終獲得14 698個(gè)mRNA和1376個(gè)新的lncRNA,包括1161個(gè)基因間非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA)和215個(gè)反義lncRNA(anti-sense lncRNA)。以倍數(shù)變化(Fold Change,FC)2.0和q0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn),在試驗(yàn)組與對(duì)照組間共獲得差異表達(dá)的110個(gè)lncRNA(53個(gè)上調(diào)和57個(gè)下調(diào))和948個(gè)mRNA(656個(gè)上調(diào)和292個(gè)下調(diào))。隨機(jī)選擇10個(gè)mRNA(5個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào))和10個(gè)lncRNA(5個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào))進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)qRT-PCR的結(jié)果與RNA測(cè)序(RNA-seq)的結(jié)果一致,從而驗(yàn)證了RNA-seq分析的有效性。此外,本研究利用qRT-PCR方法還檢測(cè)了部分差異表達(dá)基因(6個(gè)mRNA和6個(gè)lncRNA)在C.baileyi感染后不同時(shí)間點(diǎn)(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、10 d、16 d、28 d和29 d)的表達(dá)水平變化,發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)均有不同程度的顯著變化。靶基因預(yù)測(cè)顯示,在14 418個(gè)mRNA和2570個(gè)lncRNA之間包含634 780條對(duì)應(yīng)關(guān)系,并且一個(gè)lncRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)mRNA,一個(gè)mRNA也可以對(duì)應(yīng)于多個(gè)lncRNA,這些lncRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-4、IL-10、IL-17等細(xì)胞因子參與C.baileyi的感染與清除過(guò)程。功能富集分析發(fā)現(xiàn),差異的mRNA和lncRNA的靶基因顯著富集于Cryptosporidium感染相關(guān)的免疫通路。3.獲得了C.baileyi感染雛雞的circRNA表達(dá)譜:取C.baileyi感染后10 d試驗(yàn)組和對(duì)照組的雛雞氣管組織,進(jìn)行circRNA測(cè)序,共獲得9085個(gè)circRNA。以FC2.0和p0.05為標(biāo)準(zhǔn),共篩選出104個(gè)差異顯著的circRNA,包括65個(gè)上調(diào)和39個(gè)下調(diào)的circRNA。利用qRT-PCR方法對(duì)隨機(jī)挑選的6個(gè)差異表達(dá)的circRNA(3個(gè)上調(diào)和3個(gè)下調(diào))進(jìn)行驗(yàn)證,其結(jié)果與RNA-seq結(jié)果的表達(dá)趨勢(shì)相一致。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在9085個(gè)circRNA和978個(gè)miRNA之間存在相互作用關(guān)系。功能分析結(jié)果表明,差異circRNA的來(lái)源基因主要富集于一些代謝通路。另外,qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的4個(gè)circRNA(2個(gè)上調(diào)和2個(gè)下調(diào))在C.baileyi感染的整個(gè)過(guò)程中均有顯著變化,提示它們可能參與宿主與病原之間的相互作用。綜上所述,本研究首次運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)雛雞感染C.baileyi后的mRNA、lncRNA和circRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析,共獲得差異表達(dá)的948個(gè)mRNA、110個(gè)lncRNA和104個(gè)circRNA,這些RNA可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)在C.baileyi和宿主互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,這些預(yù)測(cè)的mRNA、lncRNA和circRNA的相關(guān)信號(hào)通路將可用于充分揭示C.baileyi感染的發(fā)病機(jī)制。
【圖文】：

鏡樣品制備與觀察感染后 10 d 剖殺雛雞，取其氣管組織，切成 2 mm3大小的方理鹽水沖洗，戊二醛溶液固定 24 h 以上，取出修成 1 mm3大S 多次沖洗（每次大約 10 min）；鋨酸再固定 2 h，PBS 沖洗幾次；經(jīng)過(guò) 30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮（3 次）脫水（每入醋酸異戊酯中置換，于二氧化碳臨界點(diǎn)干燥、噴金，用掃檢查結(jié)果蔗糖漂浮法處理試驗(yàn)組雛雞糞便樣品（圖 2-1A）以及用胰（圖 2-1B），均在顯微鏡下檢出了 C. baileyi 卵囊，可看到為粉紅色的橢圓形，，卵囊內(nèi)隱約可見(jiàn)的部分黑色實(shí)心結(jié)構(gòu)為

A 標(biāo)準(zhǔn) DL 2000；1，9，19，31，49，59. 陰性對(duì)照；2. 感染前組織樣品；3～7，1，40～47，54～57，66～71. 感染后 0~31 d 試驗(yàn)組組織樣品；10～13，20～24，32～353，60～65. 對(duì)照組組織樣品；8，18，30，48，58，72. 陽(yáng)性對(duì)照A Marker DL 2000; 1, 9, 19, 31, 49, 59. Negative control; 2. Pre-infected tissue samples; 3-, 40-47, 54-57, 66-71. Tissue samples of the experimental group 0 to 31 d pi; 10-13, 20-24,50-53, 60-65. Tissue samples of the control group; 8, 18, 30, 48, 58, 72. Positive control圖 2-4 氣管組織樣品 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2-4 The PCR amplication of tracheal tissue samples排卵囊規(guī)律雞感染 C. baileyi 卵囊后收集糞便樣品，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算其 OPG 值，律。發(fā)現(xiàn)雛雞于感染后 5 d 開(kāi)始排卵囊，在 10 d pi 和 16 d pi 各出現(xiàn)一個(gè)并且 10 d pi 的卵囊數(shù)量最多，感染后 29 d 排卵囊結(jié)束（圖 2-5）。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊峰;易凡;曹慧青;梁子才;杜權(quán);;長(zhǎng)鏈非編碼RNA研究進(jìn)展[J];遺傳;2014年05期

2 姜健閣;許y斏

本文編號(hào)：2599960