【摘要】：瘧疾是由真球蟲目,瘧原蟲科,瘧原蟲屬的瘧原蟲是引發(fā)的寄生蟲病,目前常見感染人類的瘧原蟲有4種,分別是惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum),間日瘧原蟲(Plasmodium vivax),卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)和三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)。2017年WHO報道,瘧疾仍然在91個國家和地區(qū)發(fā)生和流行,有2.16億瘧疾感染病例,42.9萬人因瘧疾而死亡,其中70%的死亡病例為五歲以下兒童。由于沒有有效的瘧疾疫苗,藥物治療仍是目前防治瘧疾的重要手段,但是瘧原蟲抗藥性的出現(xiàn)和傳播,導(dǎo)致目前有效的抗瘧藥物的力不從心,督促著新型抗瘧藥物的開發(fā)和抗藥機(jī)制的研究�；谏鲜鰡栴},本研究主要進(jìn)行了以下兩方面的工作。第一部分臨床惡性瘧原蟲株對小分子化合物庫的篩選和潛在抗藥性分析本實驗室前期從中國和緬甸邊境病人樣本中分離出67株臨床惡性瘧原蟲蟲株,使用常用的抗瘧藥物篩選后,發(fā)現(xiàn)8株瘧原蟲出現(xiàn)了抗藥性,體現(xiàn)在半數(shù)致死量(IC_(50))增加或蟲體生存率的提高。本研究利用這8株臨床抗藥性惡性瘧原蟲蟲株,對新型抗瘧試劑盒Malaria Box中的356種化合物進(jìn)行了篩選,這些化合物對所有蟲株的平均IC_(50)位于7.7~6699.7 nM。進(jìn)一步選出其中抑制效果較好的前15%共54種化合物,其平均IC_(50)范圍是7.7~269.1 nM,這些化合物具有發(fā)展成為新型抗瘧藥物的可能。ChemMine tools分析這54種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系,共分為48個組別,顯示出化合物構(gòu)架的多樣性,暗示出藥物作用途徑的豐富性。對比臨床蟲株與無特定抗藥性蟲株3D7的IC_(50)差異倍數(shù),定義5倍以上差異為相異化合物表型(DCPs),具有DCPs的化合物意味著在臨床瘧原蟲出現(xiàn)抗藥性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)臨床蟲株對17種化合物敏感性下降,顯示了臨床蟲株對新型抗瘧化合物的潛在抗藥性。進(jìn)一步對比已知多種藥物抗性蟲株Dd2,臨床蟲株也顯示對11種化合物敏感性減弱,說明臨床蟲株抗藥性的多樣性。全基因組測序所用惡性瘧原蟲株,共發(fā)現(xiàn)11690單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs),將所得的各株的SNPs合成一條假序列,進(jìn)化分析顯現(xiàn)了各蟲株間親緣關(guān)系。與已知抗藥性Dd2相比,臨床蟲株在56個基因的SNP與之不同,進(jìn)一步的統(tǒng)計學(xué)分析得到21種基因的SNP與8種化合物敏感性相關(guān)。值得關(guān)注的有1號染色體的ATP依賴性RNA解旋酶(PF3D7_0103600),14號染色體的plasmepsin I(PF3D7_1407900)和易位子組件PTEX150(PF3D7_1436300)基因位點等。另外定義了48種基因上的113個拷貝數(shù)的變異(copy-number variation,CNV),發(fā)現(xiàn)了11種基因的CNV與4種化合物敏感性相關(guān)。其中值得關(guān)注有8號染色體的熱休克蛋白70(PF3D7_0818900)和10號染色體的肝階段抗原-1(PF3D7_1036400)。在本研究中,一方面我們鑒定出Malaria Box中抑蟲效果良好的新型化合物,另一方面檢測到臨床蟲株對部分新型抗瘧化合物的潛在抗藥性,進(jìn)而對其抗性機(jī)制進(jìn)行研究。本研究不僅對新型抗瘧藥物的研發(fā)和使用具有指導(dǎo)意義,也為抗藥性機(jī)制提供了新的線索。第二部分體外誘導(dǎo)雙氫青蒿素抗藥性惡性瘧原蟲株的抗藥性機(jī)制研究世界衛(wèi)生組織推薦青蒿素聯(lián)合療法作為治療瘧疾的首選方案。然而在東南亞的一些地區(qū),對青蒿素有抗藥性的惡性瘧原蟲的興起和傳播,嚴(yán)重威脅著全球瘧疾的防治。惡性瘧原蟲抗ART藥物機(jī)制一直是研究的重要方向,在科學(xué)家的不懈努力下,通過實驗室篩選或者GWAS分析發(fā)現(xiàn)了一些重要抗藥性機(jī)理,但尚未完全闡明。本研究經(jīng)過759天雙氫青蒿素(DHA)藥物體外誘導(dǎo)篩選,獲得了抗性較高的惡性瘧原蟲克隆蟲株�？顾幮韵x株的半數(shù)致死量(IC_(50))為母本蟲株Dd2的21倍。環(huán)狀體(RSA)和滋養(yǎng)體(TSA)存活率大幅上升,抗藥性蟲株可耐受20μM的DHA短時間處理。分析發(fā)現(xiàn)TSA與IC_(50)相關(guān)性更大,一定程度上解釋了經(jīng)典IC_(50)表型測定方法不適用于鑒定ART類藥物抗性的原因。另外,抗藥性蟲株對其他ART衍生物(青蒿琥酯,蒿甲醚)分別表現(xiàn)出8和10倍的增長,說明了化合物特性結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)的抗藥性的不同;同時其對氯喹和甲氟喹藥物抗藥性的增加證實了共同抗藥機(jī)制的存在。進(jìn)一步觀察DHA抗藥性蟲株紅內(nèi)期生長方式和生長周期,發(fā)現(xiàn)抗性蟲株延長了環(huán)狀體時期,導(dǎo)致整個生長周期增長。全基因組范圍內(nèi)對比分析抗性蟲株與母本蟲株Dd2的差別,共得到分布于35種基因的190個SNPs。其中一部分結(jié)果驗證了之前鑒定的抗性位點如pfATG18(PF3D7_1012900),蛋白激酶7(PF3D7_0213400)和保守的瘧原蟲膜蛋白(PF3D7_1464500)等,證明了這些基因位點的重要性。另一部分新出現(xiàn)的基因位點,如DNA修復(fù)和重組蛋白54(PF3D7_0803400),甲酸鹽-亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(PF3D7_0316600)和雙鏈斷裂修復(fù)蛋白(PF3D7_0107800)等,為ART抗藥性機(jī)制的研究提供了新思路。另外,本研究發(fā)現(xiàn)了26個基因CNVs變化,全部為拷貝數(shù)增加,值得關(guān)注的是九個抗氧化途徑的基因;六個線粒體蛋白;兩個熱休克蛋白;三個離子轉(zhuǎn)運蛋白;泛素蛋白連接酶E3。它們分別在氧化還原、氧化供能途徑和泛素化等方面,發(fā)揮對抗藥物的作用。研究結(jié)果為惡性瘧原蟲抗DHA機(jī)制的研究提供了新的線索。惡性瘧原蟲抗DHA藥物機(jī)制是一個多分子參與的過程,不可能僅僅通過幾個基因位點的SNP或者CNV來完全闡明,本研究進(jìn)一步完善了惡性瘧原蟲抗DHA藥物的分子機(jī)制,為全面揭示抗藥性機(jī)制打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

吉 大學(xué)博士學(xué)位論文紅細(xì)胞的機(jī)制，進(jìn)行論述。的形成蚊通過叮咬感染瘧疾的病人獲得了雄性和雌性兩tes），隨著按蚊腸道內(nèi)酸堿度（PH）和黃尿酸濃度的改有絲分裂形成八個雄性動合子，在 Pfs48/45 基因調(diào)控下進(jìn)入雌配子母細(xì)胞，從而形成受精合子，之后發(fā)育為動細(xì)胞，在胃基底膜形成球形卵囊，此過程受 DOZI 基因分裂和減數(shù)分裂，生成數(shù)以萬計的子孢子，在卵囊破裂循環(huán)集中于按蚊的唾液腺經(jīng) 10-12 天發(fā)育成熟[7, 8]。成熟叮咬人類會再次進(jìn)去人體。

巢氏 PCR 流程示意圖（Balbir Singh et al, Am. J. Trop. Med. Hyg.Fig. 1.2 Schematic representation of oligonucleotides used in the nepolymerase chain reaction (PCR) assayDNA 探針技術(shù)于不同種類的瘧原蟲，設(shè)計出特異性探針，再結(jié)合標(biāo)記的靈敏性的使用，，從而對瘧原蟲的診斷及蟲種的鑒定。在 P. falciparum 檢達(dá)到了 0.0001％蟲血癥。雖然 DNA 探針技術(shù)具有敏感性和特異存在著操作繁鎖、同位素污染等缺點。此法在實際使用中很少見疾疫苗的研究進(jìn)展于瘧原蟲復(fù)雜生活史和抗原的多樣性，這使得疫苗的研制面臨著目前科學(xué)家在瘧原蟲各個生活史階段、多階段/多抗原疫苗以及全
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.7

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本文編號：2599761