【摘要】：沙門(mén)菌是一種重要的食源性病原菌,絕大部分血清型對(duì)人和動(dòng)物具有致病性,可引起多種不同臨床表現(xiàn)的沙門(mén)菌病。研究沙門(mén)菌感染宿主的致病機(jī)制對(duì)預(yù)防和控制沙門(mén)菌病具有重要現(xiàn)實(shí)意義。細(xì)菌非編碼小RNA(Small non-coding RNA,sRNA)是一類基因組中被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子,通過(guò)感應(yīng)外界環(huán)境變化,在轉(zhuǎn)錄后水平快速調(diào)節(jié)基因表達(dá)。RyhB是存在于沙門(mén)菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌中的一種sRNA。沙門(mén)菌編碼兩種RyhB同源物:RyhB-1和RyhB-2,二者可參與鐵代謝、能量代謝、硝酸鹽代謝、氧化應(yīng)激、耐酸性、耐藥性等多種生命代謝過(guò)程的調(diào)控,但RyhB對(duì)毒力相關(guān)靶標(biāo)基因的調(diào)控研究較少。本研究通過(guò)構(gòu)建體外模擬腸道環(huán)境(Simulated Intestinal Environmentin vitro,SIE)模型,探究腸炎沙門(mén)菌在模擬腸道環(huán)境時(shí)RyhB的轉(zhuǎn)錄情況,篩選該條件下RyhB調(diào)控的毒力相關(guān)靶標(biāo)基因,并對(duì)其調(diào)控機(jī)制及對(duì)宿主致病性作用進(jìn)行深入研究。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.低鐵、無(wú)氧和模擬腸道環(huán)境對(duì)RyhB-1和RyhB-2轉(zhuǎn)錄的影響缺氧和鐵匱乏是腸炎沙門(mén)菌及其它腸道菌感染宿主時(shí)必須面對(duì)的環(huán)境壓力。為研究低鐵、無(wú)氧和模擬腸道環(huán)境對(duì)RyhB轉(zhuǎn)錄的影響以及兩種RyhB同源物之間的轉(zhuǎn)錄關(guān)系,本研究檢測(cè)了腸炎沙門(mén)菌SE50336野生株、ryhB-1缺失株、ryhB-2缺失株、ryhB-1/ryhB-2雙缺失株在低鐵、無(wú)氧、模擬腸道環(huán)境下的生長(zhǎng)情況,以及RyhB-1和RyhB-2的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與LB培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)條件下相比,低鐵、無(wú)氧條件和模擬腸道環(huán)境培養(yǎng)條件下,所有沙門(mén)菌菌株生長(zhǎng)緩慢;相同培養(yǎng)條件下,ryhB單缺失或雙缺失均影響細(xì)菌生長(zhǎng)。低鐵、無(wú)氧和模擬腸道環(huán)境均可誘導(dǎo)RyhB-1和RyhB-2的高轉(zhuǎn)錄,尤其是模擬腸道環(huán)境下,二者表達(dá)量與常規(guī)培養(yǎng)條件相比分別升高70、60倍,表明RyhB-1和RyhB-2在沙門(mén)菌適應(yīng)以上不良環(huán)境中發(fā)揮重要作用;單一ryhB缺失可導(dǎo)致另一RyhB 同源物表達(dá)量增加,推測(cè)兩種RyhB同源物之間存在表達(dá)互補(bǔ)作用。2.模擬腸道環(huán)境下RyhB調(diào)控靶標(biāo)基因的篩選為研究腸炎沙門(mén)菌自然感染宿主時(shí)RyhB的調(diào)控作用,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析比較了模擬腸道環(huán)境條件下腸炎沙門(mén)菌野生株、ryhB-1缺失株、ryhB-2缺失株、ryhB-1/ryhB-2雙缺失株的轉(zhuǎn)錄組變化,以篩選模擬腸道環(huán)境條件下RyhB調(diào)控的靶標(biāo)基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,與野生株相比,ryhB-1、ryhB-2單缺失和雙缺失株中分別有496、250、553個(gè)差異表達(dá)基因(Different Expression Genes,DEGs),其中受RyhB-1和RyhB-2共同調(diào)控的靶基因有363個(gè),受RyhB-1單獨(dú)調(diào)控的靶基因有188個(gè),受RyhB-2單獨(dú)調(diào)控的靶基因有110個(gè)。挑選了 14個(gè)差異表達(dá)基因,利用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的正確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致,表明轉(zhuǎn)錄分析數(shù)據(jù)可信度高,可繼續(xù)下一步分析。GO分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因的分子功能主要富集到輔因子轉(zhuǎn)運(yùn)活性、亞鐵血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)和ATP酶活性上,而生物過(guò)程和細(xì)胞組成主要富集到輔因子轉(zhuǎn)運(yùn)、亞鐵血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)復(fù)合物生物合成與組裝等功能上。KEGG分析結(jié)果顯示,DEGs富集較多的通路包括硝酸鹽代謝通路、雙組份系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞等毒力相關(guān)基因。3.RyhB-1和RyhB-2對(duì)毒力相關(guān)靶基因的調(diào)控作用機(jī)制研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),模擬腸道環(huán)境條件下,RyhB-1和RyhB-2可上調(diào)編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白sipA和sopE基因的表達(dá),抑制參與沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制的ssaI和sseA基因的表達(dá)。為進(jìn)一步研究RyhB-1和RyhB-2對(duì)以上靶基因的調(diào)控機(jī)制,本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)RyhB與上述靶基因的結(jié)合位點(diǎn),利用雙質(zhì)粒熒光報(bào)告系統(tǒng)證明調(diào)控機(jī)制(激活或抑制)。結(jié)果顯示,RyhB-1和RyhB-2可直接與sipA mRNA的5' UTR相互作用,使位于sipA mRNA 5' UTR上原本閉合的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome Bind Site,RBS)暴露出來(lái),促進(jìn)翻譯進(jìn)程;RyhB-1和RyhB-2亦可直接與ssaI mRNA形成不完全互補(bǔ)配對(duì),抑制ssaI翻譯。而RyhB-1和RyhB-2對(duì)sopE和sseA基因起間接調(diào)控作用。4.RyhB-1和RyhB-2調(diào)控沙門(mén)菌侵襲和胞內(nèi)存活與復(fù)制為進(jìn)一步探究模擬腸道環(huán)境下RyhB對(duì)宿主致病性調(diào)控作用,通過(guò)MEAT(Murine Ex vivo Anaerobic Tissue,MEAT model)模型證明ryhB缺失后,腸炎沙門(mén)菌對(duì)小鼠腸道上皮細(xì)胞侵襲能力減弱,推測(cè)在自然感染宿主后,RyhB-1和RyhB-2被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄,通過(guò)與sipA mRNA 5' UTR相互作用,激活后者翻譯,影響腸炎沙門(mén)菌對(duì)上皮細(xì)胞侵襲能力。巨噬細(xì)胞內(nèi)存活試驗(yàn)表明,ryhB缺失導(dǎo)致腸炎沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞中存活能力減弱,但復(fù)制能力增強(qiáng),推測(cè)RyhB-1和RyhB-2通過(guò)直接抑制參與腸炎沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活與復(fù)制的效應(yīng)蛋白SsaI表達(dá),調(diào)控腸炎沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活與復(fù)制。
【圖文】：

降低對(duì)細(xì)胞的損傷［９１］。而ＲｙｈＢ可調(diào)控ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋的比例起抗氧化應(yīng)激作用。因逡逑為沙門(mén)菌兩種ＲｙｈＢ都參與調(diào)控與三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白（如編碼琥珀酸脫氫酶）逡逑的ｍＲＮＡ邋（圖１Ｃ）邋［５７，，９２］。研宄發(fā)現(xiàn)，Ｈ２０２作用后，沙門(mén)菌中的缺失可引起ＮＡＤＨ逡逑水平增加［９（）］。因此，推測(cè)ＲｙｈＢ通過(guò)調(diào)控電子通量平衡和細(xì)胞內(nèi)Ｒ０Ｓ水平相關(guān)的基因表達(dá)逡逑起抗氧化應(yīng)激作用。逡逑此外，／ｗｒ缺失株中，缺失可增強(qiáng)／ｗｒ缺失株抗Ｈ２０２的能力，表明ＲｙｈＢ－ｌ和ＲｙｈＢ－２逡逑抗氧化應(yīng)激的作用受到Ｆｕｒ蛋白影響，推測(cè)與缺失引起含鐵蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞逡逑內(nèi)游離鐵含量增加有關(guān)［９３］。逡逑

邐陳斌杰：腸炎沙門(mén)菌非編碼�。遥危粒遥瑁抡{(diào)控毒力相關(guān)靶基因的篩選、鑒定和功能研究逡逑作用時(shí)（圖１－２Ｄ），ＷＴ生長(zhǎng)更為緩慢，表明這兩種極端環(huán)境均不利于Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ生長(zhǎng)。逡逑值得注意的是，無(wú)氧環(huán)境中ＷＴ生長(zhǎng)較低鐵環(huán)境好，表明鐵元素缺失更不利于沙門(mén)菌生長(zhǎng)。逡逑無(wú)論在無(wú)氧還是低鐵環(huán)境中，0；／出單基因缺失或雙基因缺失菌株均出現(xiàn)了一定程度生逡逑長(zhǎng)缺陷，表明ｓＲＮＡ邋ＲｙｈＢ－１和ＲｙｈＢ－２在這兩種極端環(huán)境中對(duì)Ｓ．邋Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ生長(zhǎng)具有重要逡逑影響。逡逑Ａ邋４，邐Ｂ邐＋邋ＷＴ逡逑＊邋ｎ邋ｈＨ￣Ｊ邋ｍｕｔａｎｔ逡逑ｙ邐？邐，邋ｆ邐ｎ邋ｈＢ－２邋ｍｕｔａｎｔ逡逑９邐00２邐，邋￡邐？邐ｎｈＢｓ邋ｎｎｉｌａｎｔ逡逑ｂ邐ｉ邋＊逡逑ｏ．ｉ＇邋／Ｆ逡逑：Ｚ＿＿＿邐ｊ逡逑0邋？邐？？邐？邐00０邋？邋Ｍ邋１８邐２４逡逑，＃１邐０邋２０－１逡逑Ｌ廣邐卜Ｚ逡逑Ｊ邐＿ｙ逡逑？邐？邋Ｕ邋Ｉｔ邋２４邐０邐？邐１２邐１？邐２４逡逑圖１－２．邋ＷＴ
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2599490