【摘要】：弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmsis)是由弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii,T.gondii)引起的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng),其宿主廣泛且生活史較復(fù)雜。作為機(jī)會(huì)性致病寄生蟲(chóng),弓形蟲(chóng)能夠使免疫缺陷患者表現(xiàn)出弓形蟲(chóng)病癥狀,甚至死亡。全球約1/3的人口受弓形蟲(chóng)威脅;弓形蟲(chóng)也能夠引起動(dòng)物爆發(fā)弓形蟲(chóng)病,豬急性感染弓形蟲(chóng)死亡率可達(dá)60%�？傊�,弓形蟲(chóng)病嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康,并給畜牧業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失。弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白質(zhì)在弓形蟲(chóng)入侵過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,主要參與黏附宿主細(xì)胞、形成移動(dòng)連接、形成和修飾納蟲(chóng)空泡及調(diào)節(jié)宿主轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。黏附是弓形蟲(chóng)入侵的第一步,弓形蟲(chóng)表面抗原和分泌蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞表面受體互作,促進(jìn)蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞。硫化肝素(Heparan sulfate,HS)為廣泛分布于脊椎動(dòng)物細(xì)胞表面的無(wú)支鏈多糖,弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白質(zhì)與肝素/HS結(jié)合的研究相對(duì)較少。弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制尚不清晰,且弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)在入侵過(guò)程中行使的功能也尚未有全面報(bào)道。因此,研究弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)的功能,將為進(jìn)一步闡明弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本課題對(duì)與肝素結(jié)合的弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)的棒狀體蛋白質(zhì)9(ROP9)、微線(xiàn)體蛋白質(zhì)3(MIC3)和表面抗原2(SAG2)進(jìn)行功能研究,不僅為揭示肝素在弓形蟲(chóng)入侵過(guò)程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為研制弓形蟲(chóng)新型疫苗和藥物靶標(biāo)提供理論依據(jù)。本研究通過(guò)對(duì)編碼ROP9、MIC3和SAG2的氨基酸進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)此三種蛋白質(zhì)在弓形蟲(chóng)種內(nèi)均具有較高的保守性,且均具有良好的B細(xì)胞表位,表明其可能是弓形蟲(chóng)的較重要蛋白質(zhì)且具有弓形蟲(chóng)疫苗和診斷候選抗原的潛力。為了對(duì)弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析,本研究利用原核表達(dá)載體分別表達(dá)和純化了His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽重組蛋白質(zhì),并成功制備了特異性多克隆抗體。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitive real-time PCR,RT-PCR)和Western blot對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在弓形蟲(chóng)RH株中,ROP9、MIC3和SAG2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平在體外均高于體內(nèi)。通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(Indirect immunofluorescence assay,IFA)對(duì)蛋白質(zhì)在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)ROP9、MIC3和SAG2蛋白質(zhì)在入侵的過(guò)程中的表達(dá)量明顯高于游離蟲(chóng)體的表達(dá)量。通過(guò)肝素結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)抑制及細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn),證明了ROP9、MIC3和SAG2蛋白質(zhì)能夠與肝素特異性結(jié)合并黏附于宿主細(xì)胞表面。為了進(jìn)一步研究封閉弓形蟲(chóng)或宿主細(xì)胞表面的入侵位點(diǎn)對(duì)蟲(chóng)體入侵力的影響,進(jìn)行了外源肝素、蛋白質(zhì)和抗體抑制蟲(chóng)體入侵分析,結(jié)果表明,外源肝素可以阻斷弓形蟲(chóng)的入侵,且蛋白質(zhì)MIC3、SAG2和ROP9與其高濃度的特異性多克隆抗體均可抑制T.gondii RH株蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞。通過(guò)感染弓形蟲(chóng)的人血清識(shí)別蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MIC3、SAG2和ROP9免疫識(shí)別的特性,結(jié)果提示蛋白質(zhì)ROP9、MIC3和SAG2均能被免疫識(shí)別,且對(duì)BALB/c小鼠有部分的免疫保護(hù)效果。為進(jìn)一步探索ROP9蛋白質(zhì)對(duì)弓形蟲(chóng)的入侵力和毒力相關(guān)性的影響,本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了弓形蟲(chóng)ROP9基因敲除株(RH△ROP9)和補(bǔ)回株(RH-Re ROP9),并通過(guò)入侵率、增殖率、胞出時(shí)間和對(duì)小鼠的致病性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),弓形蟲(chóng)ROP9基因敲除株入侵宿主細(xì)胞的速率明顯下降,且對(duì)小鼠的致病性減弱。目前尚未有能完全預(yù)防和控制弓形蟲(chóng)病的疫苗和藥物,因此,急需研發(fā)安全且有效的新型弓形蟲(chóng)疫苗。本研究利用已篩選出的編碼弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行構(gòu)建重組腺病毒,并對(duì)其進(jìn)行免疫原性分析。分別將弓形蟲(chóng)ROP9、MIC3和SAG2基因克隆至腺病毒穿梭載體,并將其與腺病骨架載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),成功包裝出了表達(dá)目的蛋白質(zhì)的重組腺病毒。將包裝出的重組腺病毒分別免疫BALB/c小鼠并進(jìn)行免疫原性分析,結(jié)果顯示,免疫小鼠獲得較高的特異性的抗弓形蟲(chóng)Ig G;重組腺病毒組小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α及IL-6等Th1型細(xì)胞因子顯著或極顯著高于對(duì)照組(P0.05、P0.01或P0.001);二價(jià)或三價(jià)重組腺病毒組小鼠脾臟中活化的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞顯著或極顯著高于對(duì)照組(P0.05、P0.01或P0.001);且免疫小鼠的存活率及存活時(shí)間極顯著增加(P0.01或P0.001)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)蛋白質(zhì)ROP9、MIC3和SAG2能夠與肝素特異性結(jié)合,并與宿主細(xì)胞發(fā)生黏附;弓形蟲(chóng)ROP9蛋白質(zhì)參與弓形蟲(chóng)的入侵,且是弓形蟲(chóng)的一個(gè)毒力因子;重組腺病毒免疫小鼠,能夠激起小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫,且對(duì)小鼠有部分的免疫保護(hù)作用。該研究結(jié)果不僅為闡明弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為研發(fā)新型弓形蟲(chóng)疫苗提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7

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