【摘要】：中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是一種能引起呼吸性疾病的致死率高的新型人冠狀病毒,能感染人、蝙蝠、單峰駱駝、羊駝等。自2012年9月至2018年4月底,WHO共報(bào)道了2206例實(shí)驗(yàn)室確診病例,其中787例死亡(死亡率約為35.7%)。在2015年,我國廣東省確診了首例輸入性中東呼吸綜合征病例,這對(duì)我國MERS疫情的防控敲響了警鐘。由于目前尚無獲批的有效疫苗和治療藥物,及時(shí)診斷和隔離是控制該病暴發(fā)流行的有效方法。MERS-CoV現(xiàn)有的檢測方法多以核酸檢測為主,WHO發(fā)布的MERS-CoV的實(shí)驗(yàn)室確診程序臨時(shí)指導(dǎo)文件中推薦使用real-time RT-PCR方法對(duì)MERS-CoV進(jìn)行檢測確診。針對(duì)MERS-CoV抗原檢測方面,雙抗體夾心ELISA、膠體金免疫層析試紙等方法已被建立。但這些方法普遍存在需昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、流程繁瑣費(fèi)時(shí)、易出現(xiàn)假陰性和假陽性的問題。為克服以上檢測方法的不足,本研究旨在建立針對(duì)MERS-CoV核酸和抗原的簡便、快速、特異的新型檢測方法。1、MERS-CoV反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸可視化(RT-LAMP-VF)檢測方法的建立與評(píng)價(jià);針對(duì)MERS-CoV N基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)6條特異性引物,用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過一次性核酸可視化裝置直接肉眼觀察。RNA轉(zhuǎn)錄本及MERS-CoV RNA對(duì)RT-LAMP-VF方法進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià);RNA轉(zhuǎn)錄本、SARS-related coronavirus(SARSr-CoV),HKU4,HKU1,OC43,229E等對(duì)其進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:擴(kuò)增體系中內(nèi)引物終濃度為0.4μM時(shí),合成的RNA轉(zhuǎn)錄本在61℃恒溫?cái)U(kuò)增30min效率最高。RT-LAMP-VF方法可在35min內(nèi)特異性檢測到2×10~1copies/μL的RNA轉(zhuǎn)錄本及1×10~1copies/μL MERS-CoV RNA,且與其他冠狀病毒等無交叉反應(yīng)。2、中東呼吸綜合征冠狀病毒量子點(diǎn)免疫層析試紙的制備;采用傳統(tǒng)的EDC偶聯(lián)法將羧基化CdTe/ZnSe量子點(diǎn)與抗MERS-CoV RBD的單克隆抗體(mAb/MERS-CoV)共價(jià)偶聯(lián),通過斑點(diǎn)免疫印跡檢驗(yàn)偶聯(lián)物的活性,以做捕獲抗體備用;以馬抗MERS-CoV IgG作為檢測抗體,在雙抗體夾心法原理基礎(chǔ)上采用免疫層析技術(shù)制備MERS-CoV量子點(diǎn)免疫層析試紙。MERS-CoV假病毒對(duì)制備的量子點(diǎn)免疫層析試紙進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià),MERS-CoV假病毒、商品化SARS-CoV S1亞蛋白、豬流行性腹瀉病毒、H5N1流感病毒病毒樣顆粒對(duì)其進(jìn)行了特異性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:5μL QDs在pH=6.4的體系中被46.8μg EDC活化后,能與16μg mAb/MERS-CoV高效率偶聯(lián),且偶聯(lián)物具有良好的生物活性。制備的MERS-CoV量子點(diǎn)免疫層析試紙可在15min內(nèi)檢測到2×5~3TCID_(50)/mL MERS-CoV假病毒,且具有較好的特異性。
【圖文】：

呼吸窘迫綜合征[27]。全球確診的 MERS-CoV 感染者的年齡范圍在 1-94 歲間（平均年齡為 49 歲），其中 65%的為男性，而大多數(shù)住院患者多為患有慢性病和免疫疾病的老年人[8, 20, 28, 29]。Assiri 等人對(duì) 47 名感染者進(jìn)行了臨床追蹤，研究數(shù)據(jù)表明 MERS-CoV 的潛伏期為5-6天，并可13-14天時(shí)引起人感染[22]。Victor等人收集了37名MERS-CoV陽性患者確診后三周內(nèi)的上/下呼吸道分泌物、血液、糞便、尿液樣品，進(jìn)行了病毒含量的測定，證明下呼吸道分泌物中病毒載量最高（平均為 5×10copies/mL），陽性檢出率最高[19]。不同于人類，MERS-CoV 感染單峰駱駝多引起上呼吸道癥狀[30]，且 RT-PC結(jié)果顯示可在單峰駱駝的鼻拭子、血清中檢測到 MERS-CoV 的存在[31]。Mulle等人對(duì)中東地區(qū)的單峰駱駝進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，90%的成年單峰駱駝體內(nèi)存在MERS-CoV 抗體，說明 MERS-CoV 在中東地區(qū)廣泛分布[32]，但現(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示在南美洲駱駝和雙峰駱駝體內(nèi)未檢測到抗 MERS-CoV 的抗體，似乎能感染MERS-CoV 的駱駝只局限于非洲和中東地區(qū)[33-35]。

顯示出與 Bst 3.0 聚合酶類似的活性，且可以直接檢測 DNA 和 RNA，更適用于全血樣本的檢測研究[66]。傳統(tǒng)的 LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物是通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察，陽性結(jié)果為特征性的階梯狀條帶[62]。由于這種方法極易造成氣溶膠污染，2001 年 Yasuyoshi 等人將鎂離子加入反應(yīng)體系中，利用擴(kuò)增中產(chǎn)生的焦磷酸根離子可與鎂離子形成白色沉淀焦磷酸鎂，，將擴(kuò)增產(chǎn)物可視化[67]。但該方法中鎂離子的加入會(huì)抑制擴(kuò)增速率，且通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷陽結(jié)果存在一定的誤差。隨后，研究者又利用 DNA 熒光染料能結(jié)合雙鏈 DNA 的特性，將核酸熒光燃料替代鎂離子加入反應(yīng)體系中，在一定波長的激發(fā)光下產(chǎn)生熒光讀取結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定性檢測[68, 69]。最近幾年，很多研究者將 LAMP 與微流體芯片相組合，提高了 LAMP 即時(shí)診斷中的實(shí)用性[70]。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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2 胡紀(jì)文;熊建輝;陳卓誠;王貴萍;葉蕾;張大準(zhǔn);;人肺炎支原體抗原量子點(diǎn)免疫層析法的建立[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2015年07期

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本文編號(hào)：2598168