【摘要】：電針鎮(zhèn)痛是20世紀針灸科學中最重要的原創(chuàng)性成果,由于其安全、生理干擾少和經濟等特點,被廣泛應用于外科手術止痛和疼痛疾病的治療。現代神經生物學研究證實電針鎮(zhèn)痛是由神經和體液共同參與的生理性調節(jié)過程,早期研究發(fā)現中樞神經系統(tǒng)的多種神經遞質參與了鎮(zhèn)痛調節(jié),后期研究發(fā)現一些神經調質,尤其是內源性阿片肽,在電針鎮(zhèn)痛中發(fā)揮了更為重要的作用。電針具有良好的鎮(zhèn)痛效應,然而單次長時間或者短時間內多次電針,易引起針刺鎮(zhèn)痛效應的快速下降,產生電針耐受,有關電針耐受的研究主要集中在阿片肽、抗阿片肽以及它們的受體之上。MiRNA已被確定參與嗎啡耐受,而慢性電針耐受和嗎啡耐受存在著交叉耐受,根據兩者的相關性,本實驗室最新的研究發(fā)現miRNA(包括let-7b)也參與了電針耐受,因此,進一步探討miRNA參與電針耐受的蛋白機制,有助于尋找解決電針耐受的有效方法,降低其不利影響,促進針刺技術的推廣應用。MiRNA能夠與靶基因3'UTR通過堿基互補配對,造成靶基因翻譯受到干擾,進而造成一定的生物學效應。利用靶基因預測軟件發(fā)現Penk1可能是參與電針耐受的let-7b的靶基因,Penk1可以翻譯前腦啡肽蛋白,經酶解后產生腦啡肽。腦啡肽是中樞神經系統(tǒng)中含量最豐富的阿片肽物質,廣泛分布于整個中樞神經系統(tǒng),大量研究表明腦啡肽在電針鎮(zhèn)痛中發(fā)揮了重要的作用,而let-7b能否通過干擾Penk1基因翻譯表達來影響電針鎮(zhèn)痛效果,引起電針耐受還未被證實。通過體外培養(yǎng)大鼠下丘腦神經元細胞并構建靶基因雙熒光素酶報告質粒進行共轉染,結果表明,let-7b可以顯著抑制WT-psiCHECK2-Penk1-3'UTR雙熒光素酶報告質粒熒光信號,證明Penk1是let-7b的靶基因。為了確定let-7b在電針耐受大鼠體內也參與對Penk1基因的調控,采用72只雌性SD大鼠,隨機分成4組,分別為EA+AgoNC組、EA+AtgNC組、EA+Ago組和EA+Atg組,每組18只,對所有大鼠構建側腦室注射模型。電針前1d對4組實驗動物分別注射stable negative control(agomir空白對照)、miRNA inhibitor NC(antagomir空白對照)、agomir-let-7b和antagomir-let-7b,并在大鼠右后趾構建CFA炎癥病理模型。以2/15Hz頻率,每日在大鼠雙側“足三里-三陰交”穴位電針30min,連續(xù)7d。每次電針前后測定大鼠鼠尾痛閾,計算痛閾變化率,并于各組1d、4d和7d電針后2h隨機挑選6只大鼠,取下丘腦,通過westernblot方法檢測PENK的蛋白表達水平,并采用qPCR方法檢測let-7b的表達變化。結果顯示:電針第1d EA+Ago組與其它各組相比痛閾變化率顯著降低(p0.05);而在電針第7d EA+Atg組與其它各組相比痛閾變化率顯著升高(p0.05),表明let-7b可以影響CFA炎癥電針大鼠痛閾變化;EA+AgoNC組let-7b表達量結果顯示,電針7d后較第1d電針后let-7b表達顯著升高(p0.05);蛋白結果顯示,電針第1d EA+Ago組與其它實驗組相比PENK蛋白水平顯著降低(p0.05),而在電針第7d EA+Atg組與其它組相比PENK蛋白水平顯著升高(p0.05),表明let-7b可以影響電針后PENK的表達變化。本實驗在體外通過雙熒光素酶報告質粒,體內通過鼠尾痛閾變化率和PENK蛋白表達變化,確定了在下丘腦中,let-7b可通過靶向Penk1基因調控大鼠電針耐受,該結果在蛋白水平進一步闡明了miRNA參與電針耐受的分子機制。
【圖文】：

let-7b 通過靶向 Penk1 基因調控大鼠電針耐受b-5p 靶基因預測與驗證基因預測以及預測靶基因 3’UTR 雙熒光素酶報告載體驗采用 miRNAwalk（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zm-self.html），，預測出潛在的靶基因 495 個（部分預測結果見附表選出 Penk1 基因作為后續(xù)實驗的目的基因。本實驗使用 psiCHE 2-1），構建 Penk1-3’UTR 雙熒光素酶報告載體及其突變體的構

圖 2-1 大鼠足三里穴（ST36）、三陰交穴（SP6）（來源于華興邦等，1991）Fig. 2-1 The acupoints of “Zusanli” (ST36) and “Sanyinjiao” (SP6) in rats.(Hua Xingbang et al 1991)2.7 大鼠痛閾變化率測定采用鼠尾熱輻射測痛法進行痛閾測定(任民峰 and 韓濟生 1978)。輕柔地將大鼠置于保定筒內，固定于鼠尾熱輻射測痛儀的支架上，將鼠尾自然平放并等分為 6 段。在自尾跟起第四段做標記，用于光照測痛。將鼠尾標記點對準并緊貼光照點，記錄自光照開始至大鼠產生甩尾反應的時間。正式實驗前，先調整發(fā)光燈泡功率，使室溫下 4~6 s 引起多數大鼠的甩尾反應作為適宜刺激強度。為避免長期光照造成燙傷，設置 15 s 為大鼠甩尾反應閾的上限，超過這一限度即停止照射。電針前測定 3 次大鼠 TFL，每次間隔 5 min，取平均值作為該大鼠的基礎痛閾（電針前 TFL）。電針后測定 3 次大鼠 TFL，每次間隔 5 min，取 3 次測定平均值作為電針后痛閾。以 Δn 表
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S853.6

【參考文獻】

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10 周巖;孫宇華;樸素芬;韓濟生;;電針耐受和嗎啡耐受加速大鼠腦內八肽膽囊收縮素的合成與釋放[J];針刺研究;1991年Z1期

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本文編號：2596871