【摘要】：電針鎮(zhèn)痛是20世紀針灸科學(xué)中最重要的原創(chuàng)性成果,由于其安全、生理干擾少和經(jīng)濟等特點,被廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)止痛和疼痛疾病的治療�，F(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究證實電針鎮(zhèn)痛是由神經(jīng)和體液共同參與的生理性調(diào)節(jié)過程,早期研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)遞質(zhì)參與了鎮(zhèn)痛調(diào)節(jié),后期研究發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)調(diào)質(zhì),尤其是內(nèi)源性阿片肽,在電針鎮(zhèn)痛中發(fā)揮了更為重要的作用。電針具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng),然而單次長時間或者短時間內(nèi)多次電針,易引起針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)的快速下降,產(chǎn)生電針耐受,有關(guān)電針耐受的研究主要集中在阿片肽、抗阿片肽以及它們的受體之上。MiRNA已被確定參與嗎啡耐受,而慢性電針耐受和嗎啡耐受存在著交叉耐受,根據(jù)兩者的相關(guān)性,本實驗室最新的研究發(fā)現(xiàn)miRNA(包括let-7b)也參與了電針耐受,因此,進一步探討miRNA參與電針耐受的蛋白機制,有助于尋找解決電針耐受的有效方法,降低其不利影響,促進針刺技術(shù)的推廣應(yīng)用。MiRNA能夠與靶基因3'UTR通過堿基互補配對,造成靶基因翻譯受到干擾,進而造成一定的生物學(xué)效應(yīng)。利用靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)Penk1可能是參與電針耐受的let-7b的靶基因,Penk1可以翻譯前腦啡肽蛋白,經(jīng)酶解后產(chǎn)生腦啡肽。腦啡肽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的阿片肽物質(zhì),廣泛分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng),大量研究表明腦啡肽在電針鎮(zhèn)痛中發(fā)揮了重要的作用,而let-7b能否通過干擾Penk1基因翻譯表達來影響電針鎮(zhèn)痛效果,引起電針耐受還未被證實。通過體外培養(yǎng)大鼠下丘腦神經(jīng)元細胞并構(gòu)建靶基因雙熒光素酶報告質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染,結(jié)果表明,let-7b可以顯著抑制WT-psiCHECK2-Penk1-3'UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒熒光信號,證明Penk1是let-7b的靶基因。為了確定let-7b在電針耐受大鼠體內(nèi)也參與對Penk1基因的調(diào)控,采用72只雌性SD大鼠,隨機分成4組,分別為EA+AgoNC組、EA+AtgNC組、EA+Ago組和EA+Atg組,每組18只,對所有大鼠構(gòu)建側(cè)腦室注射模型。電針前1d對4組實驗動物分別注射stable negative control(agomir空白對照)、miRNA inhibitor NC(antagomir空白對照)、agomir-let-7b和antagomir-let-7b,并在大鼠右后趾構(gòu)建CFA炎癥病理模型。以2/15Hz頻率,每日在大鼠雙側(cè)“足三里-三陰交”穴位電針30min,連續(xù)7d。每次電針前后測定大鼠鼠尾痛閾,計算痛閾變化率,并于各組1d、4d和7d電針后2h隨機挑選6只大鼠,取下丘腦,通過westernblot方法檢測PENK的蛋白表達水平,并采用qPCR方法檢測let-7b的表達變化。結(jié)果顯示:電針第1d EA+Ago組與其它各組相比痛閾變化率顯著降低(p0.05);而在電針第7d EA+Atg組與其它各組相比痛閾變化率顯著升高(p0.05),表明let-7b可以影響CFA炎癥電針大鼠痛閾變化;EA+AgoNC組let-7b表達量結(jié)果顯示,電針7d后較第1d電針后let-7b表達顯著升高(p0.05);蛋白結(jié)果顯示,電針第1d EA+Ago組與其它實驗組相比PENK蛋白水平顯著降低(p0.05),而在電針第7d EA+Atg組與其它組相比PENK蛋白水平顯著升高(p0.05),表明let-7b可以影響電針后PENK的表達變化。本實驗在體外通過雙熒光素酶報告質(zhì)粒,體內(nèi)通過鼠尾痛閾變化率和PENK蛋白表達變化,確定了在下丘腦中,let-7b可通過靶向Penk1基因調(diào)控大鼠電針耐受,該結(jié)果在蛋白水平進一步闡明了miRNA參與電針耐受的分子機制。
【圖文】：

let-7b 通過靶向 Penk1 基因調(diào)控大鼠電針耐受b-5p 靶基因預(yù)測與驗證基因預(yù)測以及預(yù)測靶基因 3’UTR 雙熒光素酶報告載體驗采用 miRNAwalk（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zm-self.html），，預(yù)測出潛在的靶基因 495 個（部分預(yù)測結(jié)果見附表選出 Penk1 基因作為后續(xù)實驗的目的基因。本實驗使用 psiCHE 2-1），構(gòu)建 Penk1-3’UTR 雙熒光素酶報告載體及其突變體的構(gòu)

圖 2-1 大鼠足三里穴（ST36）、三陰交穴（SP6）（來源于華興邦等，1991）Fig. 2-1 The acupoints of “Zusanli” (ST36) and “Sanyinjiao” (SP6) in rats.(Hua Xingbang et al 1991)2.7 大鼠痛閾變化率測定采用鼠尾熱輻射測痛法進行痛閾測定(任民峰 and 韓濟生 1978)。輕柔地將大鼠置于保定筒內(nèi)，固定于鼠尾熱輻射測痛儀的支架上，將鼠尾自然平放并等分為 6 段。在自尾跟起第四段做標(biāo)記，用于光照測痛。將鼠尾標(biāo)記點對準(zhǔn)并緊貼光照點，記錄自光照開始至大鼠產(chǎn)生甩尾反應(yīng)的時間。正式實驗前，先調(diào)整發(fā)光燈泡功率，使室溫下 4~6 s 引起多數(shù)大鼠的甩尾反應(yīng)作為適宜刺激強度。為避免長期光照造成燙傷，設(shè)置 15 s 為大鼠甩尾反應(yīng)閾的上限，超過這一限度即停止照射。電針前測定 3 次大鼠 TFL，每次間隔 5 min，取平均值作為該大鼠的基礎(chǔ)痛閾（電針前 TFL）。電針后測定 3 次大鼠 TFL，每次間隔 5 min，取 3 次測定平均值作為電針后痛閾。以 Δn 表
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S853.6

【參考文獻】

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本文編號：2596871