【摘要】：自2010年以來(lái),新發(fā)鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)病在我國(guó)廣泛流行,給我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究擬利用弱毒疫苗株(FX2010-180P)建立的反向遺傳操作系統(tǒng),探索在該致弱毒株基因組的不同位置插入報(bào)告基因,找到一處能夠表達(dá)外源蛋白的插入位點(diǎn),為以后新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。為了探究DTMUV是否能夠穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白,利用融合PCR等方法,在DTMUV基因組的5’非編碼區(qū)(UTR)與C基因、C基因與PrM基因、PrM基因與E基因、E基因與NS1基因之間分別插入綠色熒光蛋白基因(EGFP),并在基因之間插入表達(dá)口蹄疫2A蛋白的序列;在NS5基因與3’UTR之間插入內(nèi)部核糖體引入位點(diǎn)(IRES)與EGFP,進(jìn)而獲得5’端含有啟動(dòng)子、外源基因序列的FX2010-180P株全長(zhǎng)cDNA。然后以此為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,得到具有感染性的RNA,將其轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞4d后,只有NS5基因與3’UTR之間插入外源基因的轉(zhuǎn)染孔出現(xiàn)了表達(dá)綠色熒光蛋白的重組DTMUV。將重組病毒連續(xù)傳代,發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加熒光強(qiáng)度逐漸減弱,傳至P5代熒光完全消失。測(cè)序結(jié)果顯示,重組病毒不僅丟失了IRES 3’端506個(gè)核苷酸以及整個(gè)EGFP,而且還丟失了FX2010-180P株3’端緊挨著終止密碼子的67個(gè)核苷酸。鑒于此,我們?nèi)藶槿笔н@67個(gè)核苷酸,同時(shí)插入IRES與EGFP,同樣方法進(jìn)行重組病毒拯救,發(fā)現(xiàn)病毒能夠增殖并且產(chǎn)生與親代毒相似的細(xì)胞病變,傳至第5代后熒光逐漸減弱,P7代后熒光完全消失,說(shuō)明缺失這67個(gè)核苷酸的重組病毒依舊不能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白。通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn),P2代重組病毒中至少含有12種不同長(zhǎng)度序列缺失的病毒,缺失位置也不一致,每個(gè)位置丟失序列的長(zhǎng)度也不盡相同。繼續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清中重組病毒種類逐漸減少,最后以一種或者幾種比較優(yōu)勢(shì)的狀態(tài)存在。本研究證明在NS5基因與3’UTR之間雖然能夠插入并表達(dá)外源基因,但是傳代后不穩(wěn)定;本研究獲得一系列序列缺失病毒,為研究黃病毒基因穩(wěn)定性的分子機(jī)制提供了素材,為構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源基因的病毒載體奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

表達(dá)外源基因的重組鴨坦布蘇病毒的構(gòu)建與穩(wěn)定性研究尋找可以穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因的插入位點(diǎn)，為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。TMUV 分子生物學(xué)特性TMUV 形態(tài)結(jié)構(gòu)MUV 和其它黃病毒屬病毒一樣，病毒呈球形，直徑在 40-50nm 之間(Y成熟病毒粒子被表面鑲有糖蛋白棘突的雙層磷脂分子層的囊膜包裹，囊體對(duì)稱的核衣殼蛋白，其中含有 DTMUV 基因組 RNA(Liu et al., 2013)

圖 2 DTMUV 的基因組結(jié)構(gòu)（Konstantin V. Pugachev et al., 2003）Fig. 2 The genome structure of Flavivirus（Konstantin V. Pugachev et al., 2003）研究發(fā)現(xiàn)，黃病毒具有包膜，當(dāng)病毒入侵細(xì)胞時(shí)，包膜可與被感染細(xì)胞的細(xì)胞合，形成內(nèi)涵體，隨后病毒囊膜和內(nèi)涵體融合，將 RNA 導(dǎo)入宿主細(xì)胞，即通過(guò)這種體內(nèi)吞”機(jī)制將自身遺傳信息植入被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，如圖 3。病毒 RNA 被釋細(xì)胞質(zhì)后，除了以正鏈 RNA 為模板合成負(fù)鏈 RNA 之外，，還具有 mRNA 功能，編聚蛋白前體，隨后被切割成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合中，一種叫做“融合蛋白”的物質(zhì)起著至關(guān)重要的作用，而且該物質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞質(zhì)的程度比較敏感，宿主細(xì)胞質(zhì)的酸性程度越高越有利于病毒的入侵。隨后，結(jié)構(gòu)蛋白和 E 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)形成穩(wěn)定的異源二聚體，同時(shí) C 蛋白和病毒基因組裝配后與異源體復(fù)合物結(jié)合形成不成熟的病毒粒子，進(jìn)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)反面高爾基體網(wǎng)上，在蛋白酶的作用下，形成成熟完整的病毒粒子，分泌到細(xì)胞外(Mukhopadhyay and Rossm2005)。結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒發(fā)揮功能方面有著不一樣的功能，結(jié)構(gòu)蛋白主
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2596614