發(fā)布時間：2020-03-23 10:44

【摘要】：自2010年以來,新發(fā)鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)病在我國廣泛流行,給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究擬利用弱毒疫苗株(FX2010-180P)建立的反向遺傳操作系統(tǒng),探索在該致弱毒株基因組的不同位置插入報告基因,找到一處能夠表達外源蛋白的插入位點,為以后新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。為了探究DTMUV是否能夠穩(wěn)定表達外源蛋白,利用融合PCR等方法,在DTMUV基因組的5’非編碼區(qū)(UTR)與C基因、C基因與PrM基因、PrM基因與E基因、E基因與NS1基因之間分別插入綠色熒光蛋白基因(EGFP),并在基因之間插入表達口蹄疫2A蛋白的序列;在NS5基因與3’UTR之間插入內(nèi)部核糖體引入位點(IRES)與EGFP,進而獲得5’端含有啟動子、外源基因序列的FX2010-180P株全長cDNA。然后以此為模板進行體外轉(zhuǎn)錄,得到具有感染性的RNA,將其轉(zhuǎn)染至DF-1細胞4d后,只有NS5基因與3’UTR之間插入外源基因的轉(zhuǎn)染孔出現(xiàn)了表達綠色熒光蛋白的重組DTMUV。將重組病毒連續(xù)傳代,發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加熒光強度逐漸減弱,傳至P5代熒光完全消失。測序結(jié)果顯示,重組病毒不僅丟失了IRES 3’端506個核苷酸以及整個EGFP,而且還丟失了FX2010-180P株3’端緊挨著終止密碼子的67個核苷酸。鑒于此,我們?nèi)藶槿笔н@67個核苷酸,同時插入IRES與EGFP,同樣方法進行重組病毒拯救,發(fā)現(xiàn)病毒能夠增殖并且產(chǎn)生與親代毒相似的細胞病變,傳至第5代后熒光逐漸減弱,P7代后熒光完全消失,說明缺失這67個核苷酸的重組病毒依舊不能穩(wěn)定表達外源蛋白。通過高通量測序發(fā)現(xiàn),P2代重組病毒中至少含有12種不同長度序列缺失的病毒,缺失位置也不一致,每個位置丟失序列的長度也不盡相同。繼續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn)細胞上清中重組病毒種類逐漸減少,最后以一種或者幾種比較優(yōu)勢的狀態(tài)存在。本研究證明在NS5基因與3’UTR之間雖然能夠插入并表達外源基因,但是傳代后不穩(wěn)定;本研究獲得一系列序列缺失病毒,為研究黃病毒基因穩(wěn)定性的分子機制提供了素材,為構(gòu)建穩(wěn)定表達外源基因的病毒載體奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

表達外源基因的重組鴨坦布蘇病毒的構(gòu)建與穩(wěn)定性研究尋找可以穩(wěn)定表達報告基因的插入位點，為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。TMUV 分子生物學(xué)特性TMUV 形態(tài)結(jié)構(gòu)MUV 和其它黃病毒屬病毒一樣，病毒呈球形，直徑在 40-50nm 之間(Y成熟病毒粒子被表面鑲有糖蛋白棘突的雙層磷脂分子層的囊膜包裹，囊體對稱的核衣殼蛋白，其中含有 DTMUV 基因組 RNA(Liu et al., 2013)

圖 2 DTMUV 的基因組結(jié)構(gòu)（Konstantin V. Pugachev et al., 2003）Fig. 2 The genome structure of Flavivirus（Konstantin V. Pugachev et al., 2003）研究發(fā)現(xiàn)，黃病毒具有包膜，當病毒入侵細胞時，包膜可與被感染細胞的細胞合，形成內(nèi)涵體，隨后病毒囊膜和內(nèi)涵體融合，將 RNA 導(dǎo)入宿主細胞，即通過這種體內(nèi)吞”機制將自身遺傳信息植入被感染細胞的細胞質(zhì)中，如圖 3。病毒 RNA 被釋細胞質(zhì)后，除了以正鏈 RNA 為模板合成負鏈 RNA 之外，，還具有 mRNA 功能，編聚蛋白前體，隨后被切割成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒包膜與宿主細胞膜融合中，一種叫做“融合蛋白”的物質(zhì)起著至關(guān)重要的作用，而且該物質(zhì)對宿主細胞質(zhì)的程度比較敏感，宿主細胞質(zhì)的酸性程度越高越有利于病毒的入侵。隨后，結(jié)構(gòu)蛋白和 E 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)形成穩(wěn)定的異源二聚體，同時 C 蛋白和病毒基因組裝配后與異源體復(fù)合物結(jié)合形成不成熟的病毒粒子，進而被轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)反面高爾基體網(wǎng)上，在蛋白酶的作用下，形成成熟完整的病毒粒子，分泌到細胞外(Mukhopadhyay and Rossm2005)。結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒發(fā)揮功能方面有著不一樣的功能，結(jié)構(gòu)蛋白主
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 蔣春英;魏建超;鐘登科;朱紫祥;武專昌;史子學(xué);邵東華;李蓓蓓;馬志永;;日本腦炎病毒弱毒疫苗株全長cDNA的體外合成及恢復(fù)病毒的拯救[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年07期

2 韋天超;農(nóng)海連;磨美蘭;韋平;;鴨出血性卵巢炎病原學(xué)研究進展[J];廣西畜牧獸醫(yī);2012年03期

3 曹貞貞;張存;黃瑜;刁有祥;葉偉成;劉月煥;韓婧文;馬國明;張冬冬;許豐;王丹;姜甜甜;袁媛;謝小雨;高緒慧;唐熠;施少華;萬春和;張晨;何玢;楊夢婕;陸新浩;張冰;張國中;馬學(xué)軍;張大丙;;鴨出血性卵巢炎的初步研究[J];中國獸醫(yī)雜志;2010年12期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 吳曉剛;鴨坦布蘇病毒弱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

本文編號：2596614