【摘要】：豬傳染性胸膜肺炎由胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)引起,是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。近年研究發(fā)現(xiàn),造成胸膜肺炎嚴(yán)重肺損傷的主要病理學(xué)機(jī)制是由A.pleuropneumoniae或A.pleuropneumoniae LPS引起豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)促炎因子釋放失控所致,但具體機(jī)制尚不清楚。人工感染A.pleuropneumoniae豬的肺部及肺門淋巴結(jié)中炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等的表達(dá)均顯著上調(diào),而抵抗素的表達(dá)也顯著上調(diào)。有研究表明,抵抗素能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子;同樣TLR4/NF-κB信號(hào)通路也是革蘭氏陰性菌LPS激活炎癥細(xì)胞的重要途徑;而PAMs又是肺部最早接觸病原微生物的防御細(xì)胞之一,在防止病原入侵及在肺部促炎和抑炎中均發(fā)揮重要作用。因此,試驗(yàn)基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路,研究A.pleuropneumoniae LPS、抵抗素對(duì)PAMs釋放IL-1β、IL-6和TNF-α的作用機(jī)制。試驗(yàn)一A.pleuropneumoniae LPS經(jīng)TLR4/NF-κB通路誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子以終濃度為0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL和1000 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS與PAMs作用6 h,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞,待檢。以終濃度為100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS與PAMs分別作用0 h、1.5 h、3 h、6 h和12 h,采集各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞上清及下層細(xì)胞,待檢。利用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的蛋白濃度;qRT-PCR檢測(cè)下層細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的mRNA表達(dá)水平。用終濃度為150 nmol/L的TLR4-siRNA、MyD88-siRNA和TRAM-siRNA分別與增殖達(dá)培養(yǎng)孔底部面積約70%的PAMs作用48 h后,以終濃度為100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS與PAMs作用6 h,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞,其中細(xì)胞上清檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的蛋白濃度,下層細(xì)胞檢測(cè)TLR4、MyD88、TRAM、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的mRNA表達(dá)水平。用終濃度為5μmol/L的Bay11-7082與鋪滿單層的PAMs作用2 h后,以終濃度為100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS與PAMs作用6 h,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的蛋白濃度及其mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:本試驗(yàn)中,不同濃度的A.pleuropneumoniae LPS作用PAMs 6 h或者終濃度為100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS與PAMs作用不同時(shí)間,均能提高PAMs中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的mRNA表達(dá)水平以及上清中的蛋白濃度。終濃度為1000 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS作用6 h后會(huì)致使PAMs病變,影響細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的表達(dá)。siRNA和Bay11-7082分別作用PAMs后,由A.pleuropneumoniae LPS誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的表達(dá)均顯著降低(P0.05)。上述結(jié)果表明,A.pleuropneumoniae LPS促進(jìn)PAMs中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的釋放,與其上調(diào)PAMs中TLR4、MyD88、TRAM、NF-κB等基因的表達(dá)有關(guān)。試驗(yàn)二抵抗素經(jīng)TLR4/NF-κB通路誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子以終濃度為0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL的抵抗素與PAMs作用6 h,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞(指標(biāo)檢測(cè)及方法參考試驗(yàn)一)。以終濃度為10 ng/mL的抵抗素與PAMs分別作用0 h、1.5 h、3 h、6 h、12 h和24 h,采集各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞上清及下層細(xì)胞(指標(biāo)檢測(cè)及方法參考試驗(yàn)一)。用終濃度為150 nmol/L的TLR4-siRNA、MyD88-siRNA和TRAM-siRNA分別與增殖達(dá)培養(yǎng)孔底部面積約70%的PAMs作用48 h后,以終濃度為10 ng/mL的抵抗素與PAMs作用6 h,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞(指標(biāo)檢測(cè)及方法參考試驗(yàn)一)。用終濃度為5μmol/L的Bay11-7082與鋪滿單層的PAMs作用2 h后,以終濃度為10 ng/mL的抵抗素與PAMs作用6 h,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞(指標(biāo)檢測(cè)及方法參考試驗(yàn)一)。結(jié)果:本試驗(yàn)中,不同濃度的抵抗素作用PAMs 6 h或者終濃度為10 ng/mL的抵抗素與PAMs作用不同時(shí)間,均能提高PAMs中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平以及上清中的蛋白濃度。siRNA和Bay11-7082分別作用PAMs后,由抵抗素誘導(dǎo)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均顯著降低(P0.05)。上述結(jié)果表明,抵抗素促進(jìn)PAMs中IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放,與其上調(diào)PAMs中TLR4/NF-κB通路基因的表達(dá)有關(guān)。試驗(yàn)三抵抗素與A.pleuropneumoniae LPS競(jìng)爭(zhēng)性作用于豬肺泡巨噬細(xì)胞TLR4/NF-κB通路試驗(yàn)用終濃度1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL的抵抗素與PAMs作用2 h后,用終濃度100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS繼續(xù)作用12 h,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞,檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。用終濃度為150 nmol/L的TLR4-siRNA、MyD88-siRNA和TRAM-siRNA分別與增殖達(dá)培養(yǎng)孔底部面積約70%的PAMs作用48 h后,以終濃度為10 ng/mL的抵抗素與PAMs作用2 h后,用終濃度為100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS繼續(xù)作用12 h后,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞,檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。用終濃度為5μmol/L的Bay11-7082與鋪滿單層的PAMs作用2 h后,以終濃度10ng/mL的抵抗素與PAMs作用2 h后,用終濃度100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS繼續(xù)作用12 h后,采集細(xì)胞上清及下層細(xì)胞,檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果:本試驗(yàn)中,不同濃度的抵抗素作用PAMs后,由A.pleuropneumoniae LPS誘導(dǎo)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均顯著降低(P0.05)。siRNA和Bay11-7082分別作用PAMs后,由抵抗素與A.pleuropneumoniae LPS共同誘導(dǎo)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均顯著降低(P0.05)。上述結(jié)果表明,抵抗素競(jìng)爭(zhēng)性抑制A.pleuropneumoniae LPS對(duì)PAMs中IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放,與其下調(diào)A.pleuropneumoniae LPS對(duì)PAMs中TLR4、MyD88、TRAM、NF-κB等基因的表達(dá)有關(guān)。結(jié)論:1.A.pleuropneumoniae LPS具有促進(jìn)PAMs釋放炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的作用;其作用機(jī)制與A.pleuropneumoniae LPS上調(diào)PAMs細(xì)胞中TLR4、MyD88、TRAM和NF-κB的表達(dá)有關(guān)。2.抵抗素具有促進(jìn)PAMs釋放炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用;其作用機(jī)制與抵抗素上調(diào)PAMs細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路基因的表達(dá)有關(guān)。3.抵抗素具有抑制由A.pleuropneumoniae LPS刺激PAMs釋放炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用;其作用過(guò)程與抵抗素競(jìng)爭(zhēng)性抑制PAMs細(xì)胞中TLR4、MyD88、TRAM和NF-κB的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

過(guò)程、孕酮介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程以及類固醇激素生物合成過(guò)程等 8 個(gè)信號(hào)通聯(lián)基因組富集效果顯著(P< 0.05)。在肺門淋巴結(jié)中，感染 A. pleuropneumoniae致 104 個(gè)信號(hào)通路關(guān)聯(lián)基因組上調(diào)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通聯(lián)基因組富集效果顯著(P< 0.05)。感染 A. pleuropneumoniae 導(dǎo)致了豬肺臟和肺巴結(jié)大量基因的表達(dá)譜發(fā)生顯著和/或極顯著地變化，其結(jié)果說(shuō)明了機(jī)體受到感自發(fā)啟動(dòng)免疫與能量代謝通路并刺激關(guān)聯(lián)基因組的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)動(dòng)免疫細(xì)胞發(fā)菌和抗感染功能；與此同時(shí)，，結(jié)果還顯示了受感染的肺組織和淋巴結(jié)中與炎癥有關(guān)的部分基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.05)，這可能與機(jī)體調(diào)節(jié)炎癥過(guò)度反應(yīng)有關(guān).2.5.2 A. pleuropneumoniae急性感染對(duì)豬肺部TLR4信號(hào)通路的影響上述基因芯片研究同時(shí)顯示人工感染 A. pleuropneumoniae 會(huì)激活豬肺部及肺巴結(jié)中 Toll 樣受體(Toll like receptors, TLRs)信號(hào)通路，并且導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子-1、IL-6、TNF-α 以及抵抗素基因 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)[52]。

31圖 2-1 A. pleuropneumoniae 血清 1 型脂多糖 SDS-PAGE 電泳圖（硝酸銀染色）Fig.2-1 Silver-stained SDS-PAGE profile of LPS from A. pleuropneumoniae serotype 1泳道 1 為蛋白 marker；泳道 2~4 為 A. pleuropneumoniae LPS；泳道 5 為 PBS 空白對(duì)照顯示 A. pleuropneumoniae LPS 由 O-antigen、core 和 lipid A 三部分組成。圖左側(cè)標(biāo)記分 kilodaltons, KDa)，泳道 2-4 每孔上樣量為 8 μg A. pleuropneumoniae LPS。Lane 1 for protein marker; Lane 2-4 for A. pleuropneumoniae LPS; Lane 5 for blank contr This gel showed that purified A. pleuropneumoniae LPS were composed of O-antigen, coA. Molecular mass markers (in kilodaltons) were indicated on the left. 8 μg A. pleuropneumsamples were loaded in Lane 2-4.
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

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1 金仲品;;抵抗素研究的進(jìn)展[J];濱州職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年01期

2 賈燕;王t

本文編號(hào)：2596168