【摘要】：肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良(Tibial Dyschondroplasia,TD)是指快速生長、體型較大的肉雞脛骨軟骨細(xì)胞發(fā)育異常,其臨床表現(xiàn)為行走能力部分甚至完全喪失、運(yùn)動(dòng)障礙、站立困難、骨骼發(fā)育畸形、生長性能下降等。肉雞TD主要引起脛骨近干骺端干骺面生長板內(nèi)出現(xiàn)無血管、無鈣化的半透明狀“病理軟骨栓”。大量研究顯示,肉雞TD的發(fā)生主要由于肉雞脛骨軟骨區(qū)血管生成減少,TD軟骨生長板肥大區(qū)血管數(shù)量分布密度降低,導(dǎo)致骨生成的相關(guān)細(xì)胞所需養(yǎng)分供應(yīng)不足,尤其是成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞;同時(shí)血管的減少直接導(dǎo)致鈣化區(qū)骨沉積受到破壞、鈣化終止。肉雞TD的臨床發(fā)病率較高,達(dá)10%-30%,其中多表現(xiàn)為亞臨床癥狀。TD的發(fā)生會(huì)降低肉雞抗病能力,導(dǎo)致胸部肌肉受損、囊腫,嚴(yán)重危及肉雞健康,影響肉雞產(chǎn)品品質(zhì)和性能,給肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來較為嚴(yán)重的打擊。我國家禽養(yǎng)殖業(yè)中,表現(xiàn)為臨床癥狀或亞臨床癥狀TD的發(fā)病率約為10%,給我國肉雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為了全面系統(tǒng)的了解近幾年我國肉雞TD的發(fā)病形勢(shì)、發(fā)病原因、發(fā)病過程、病理變化、相關(guān)分子機(jī)制以及防治措施,本研究采用福美雙誘導(dǎo)肉雞TD的方法構(gòu)建動(dòng)物模型,通過肉雞生長性能、TD發(fā)病情況、脛骨指數(shù)、脛骨生長板病理切片觀察、Wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)情況、TD發(fā)生后差異miRNA的篩選及靶基因表達(dá)情況等來評(píng)估肉雞TD的發(fā)病機(jī)制以及淫羊藿苷對(duì)肉雞TD的治療作用機(jī)制。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1我國部分地區(qū)肉雞TD發(fā)病普調(diào)查及其診斷近年來,肉雞TD已成為影響我國家禽養(yǎng)殖主要骨骼疾病之一,對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。為了查明我國家禽養(yǎng)殖的主產(chǎn)省份肉雞TD發(fā)病情況,本研究采用網(wǎng)絡(luò)問卷調(diào)查的方法對(duì)我國部分省市規(guī)�；怆u養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行肉雞養(yǎng)殖過程中TD發(fā)病情況調(diào)查。同時(shí),本研究采用病理剖檢和組織病理學(xué)方法相結(jié)合,對(duì)肉雞TD發(fā)生過程中的病理變化進(jìn)行比較研究。結(jié)果顯示,河北省肉雞TD發(fā)病率最高,其次是山西、河南、江蘇、山東、遼寧等省份。此外,我國近幾年肉雞表現(xiàn)TD臨床癥狀的發(fā)病率均小于5%。本研究通過對(duì)TD病變“白色軟骨栓”進(jìn)行測(cè)量,按照其與干骺端面積比值,對(duì)TD病程進(jìn)行量化。本次研究將為我國肉雞TD的發(fā)病率、診斷方法、TD病程的量化提供參考。2福美雙在誘導(dǎo)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良中的機(jī)制研究福美雙是一種重要的農(nóng)藥,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用;如果福美雙與細(xì)胞膜結(jié)合,則會(huì)引起細(xì)胞膜損傷,從而阻止血管生成。福美雙被認(rèn)為是導(dǎo)致TD發(fā)生的常見原因,福美雙在農(nóng)業(yè)上的過度使用及其在環(huán)境中的殘留,成為其污染飼料的重要原因。但是,福美雙引起肉雞TD的相關(guān)機(jī)理較為復(fù)雜,尚不明確。因此,本研究利用福美雙誘導(dǎo)肉雞TD模型,評(píng)估福美雙對(duì)肉雞內(nèi)臟器官指數(shù)、生長性能、組織病理變化、成骨細(xì)胞分化、血管分化、脛骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)等影響。結(jié)果顯示:福美雙組肉雞多表現(xiàn)為精神沉郁、運(yùn)動(dòng)障礙、站立困難、跛行。與對(duì)照組相比,福美雙組肉雞生長性能、肝臟指數(shù)和脛骨長度顯著降低,臟器指數(shù)(脾、心)、脛骨指數(shù)和TD發(fā)病的嚴(yán)重程度顯著提高;福美雙組肉雞血清中鈣、磷濃度升高,脛骨密度降低,但差異不顯著。脛骨和肝臟的組織病理學(xué)顯示,福美雙可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟毒性作用、軟骨細(xì)胞凋亡、血管分布減少。此外,免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示,福美雙組肉雞HIF-1α和VEGF的表達(dá)量顯著增加,WNT4的表達(dá)量減少。研究結(jié)果表明福美雙可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,使得脛骨生長板血管分布減少,伴隨大量死亡的軟骨細(xì)胞聚集,最終形成“軟骨栓”,伴隨成骨失敗。3肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良差異miRNA的篩選及miRNA與Wnt/β-catenin通路關(guān)聯(lián)性分析肉雞TD是許多禽類常見的骨骼疾病,但其涉及miRNA的分子機(jī)制尚未完全清楚。為此,我們通過高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)對(duì)TD肉雞差異表達(dá)的miRNA(DEGs)進(jìn)行篩選,并對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行功能注釋,通過差異表達(dá)miRNA與mRNA的關(guān)聯(lián)分析,進(jìn)而闡明影響肉雞TD的發(fā)病機(jī)制。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,TD組肉雞軟骨栓明顯增加,軟骨細(xì)胞萎縮、排列不規(guī)則。本研究共鑒定了375(P0.1)、340(P0.05)和266(P0.01)個(gè)顯著差異表達(dá)miRNAs,其中上調(diào)的分別有168、166和141個(gè),下調(diào)的分別有207、174和125個(gè)。差異表達(dá)基因GO分析和KEGG富集分析顯示,碳代謝、纈氨酸-亮氨酸和異亮氨酸降解、細(xì)胞周期等在肉雞TD發(fā)生過程中扮演重要角色。其中15種差異表達(dá)的miRNA涉及調(diào)控5種Wnt蛋白,分別為Wnt4、Wnt6、Wnt8c、Wnt9A、Wnt11,暗示肉雞TD發(fā)生后差異表達(dá)miRNAs可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響TD的發(fā)生。本研究為今后深入了解TD發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù),為今后篩選特異性miRNA作為生物標(biāo)志物以及對(duì)肉雞TD進(jìn)行有效診斷和治療提供了新的思路。4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵因子在肉雞TD發(fā)生過程中的作用Wnt/β-catenin通路在哺乳動(dòng)物骨骼發(fā)育中起到了重要的調(diào)控作用。而在家禽TD中是否也是如此,目前未見研究報(bào)到。本研究采用RT-qPCR、免疫組織化學(xué)、Western blot等方法檢測(cè)脛骨生長板Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)關(guān)鍵基因及其靶基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明:肉雞在發(fā)生TD后,脛骨干骺端生長板中Wnt5a和PKC基因表達(dá)量顯著下降,GSK-3β蛋白和p-β-catenin的表達(dá)上調(diào),同時(shí)伴隨Axin和APC的下調(diào)。另外,Wnt/β-catenin通路中CK1、Dvl、TCF和Cdk8等關(guān)鍵基因的表達(dá)量在肉雞TD發(fā)生過程中發(fā)生不同程度的下降,而sFRP的表達(dá)量升高;TD肉雞中,Wnt/β-catenin通路的靶基因Sox9、MMP9、Runx2、BMP2均出現(xiàn)不同程度的下降。研究結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其調(diào)控的下游相關(guān)因子在肉雞TD發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。5淫羊藿苷對(duì)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良的作用研究淫羊藿苷是一種傳統(tǒng)的中藥,廣泛應(yīng)用于各種骨骼疾病的治療,但淫羊藿苷對(duì)TD是否有治療作用尚無報(bào)道。為了探討淫羊藿苷對(duì)肉雞TD的治療效果,將180只AA肉雞隨機(jī)分為對(duì)照組、TD組、淫羊藿苷組(10 mg/kg/day);其中,TD組由日糧中添加福美雙誘導(dǎo)。通過RT-qPCR和Western blot分析WNT4、VEGF、P2RX7基因的表達(dá);通過脛骨各參數(shù)、軟骨細(xì)胞發(fā)育、血管生成等評(píng)估淫羊藿苷的治療作用。結(jié)果表明:與TD組相比,淫羊藿苷組WNT4和P2RX7的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05),VEGF的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05);同時(shí)生長板的寬度恢復(fù),軟骨栓變小、軟骨細(xì)胞損傷降低,促進(jìn)生長板血管的發(fā)育,肉雞的生長性能顯著提高,且肉雞的跛行程度減輕。本研究系統(tǒng)地從臨床癥狀、生理生化指標(biāo)、脛骨參數(shù)及基因表達(dá)的差異等角度評(píng)估了淫羊藿苷對(duì)肉雞TD的治療效果。該研究將為今后TD的傳統(tǒng)中藥預(yù)防和治療提供參考。
【圖文】：

福美雙致肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良的分子機(jī)制及淫羊藿苷的治療作用ori 2016，Mehmood et al 2018）。主要病理特征是，白玉狀軟骨栓的起的干骺端附近脛骨生長板大量無血管化和無鈣化。TD 的發(fā)生對(duì)家長及發(fā)育構(gòu)成嚴(yán)重威脅，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Komorood et al 2018）。大量研究表明，TD 的發(fā)生大致包括兩個(gè)方面：一是分化、凋亡和增殖過程受損，軟骨細(xì)胞蛋白分泌功能異常，導(dǎo)致軟骨ECM）降解速率降低（Rath et al 1997，Shahzad et al 2015）。不能為過程構(gòu)建足夠的空間結(jié)構(gòu)；二是生長板（GP）中血管生成被破壞，，降的血管浸潤，導(dǎo)致血管無法為破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞提鈣化軟骨區(qū)（CCZ）成骨鈣化沉積失敗（劉晶英 2015，Li et al 2008，M018，Yao et al 2018）。最后，形成白色軟骨栓，如圖 1 所示。

軟骨細(xì)胞從上到下有序地進(jìn)行分化、增殖和成熟。當(dāng)軟骨內(nèi)血多時(shí)，軟骨細(xì)胞開始向外延伸，成骨細(xì)胞增加，軟骨鈣化增強(qiáng)（劉晶英 20，軟骨生長板區(qū)血管由鈣化區(qū)向增殖區(qū)延伸，正常的軟骨細(xì)胞應(yīng)具有大的構(gòu)，體積相對(duì)較小，細(xì)胞核多在中心位置（劉晶英 2015）。TD 肉雞中，出現(xiàn)死亡、凋亡，干骺端血管壞死、中斷、分布數(shù)量減少，軟骨鈣化程度文霞 2007）。TD 肉雞發(fā)病初期，軟骨細(xì)胞核扁平，多靠近細(xì)胞膜；隨著深，出現(xiàn)核固縮和核破裂（劉晶英 2015）。骨小梁排列歪曲、混亂（Zhang8b）。研究人員發(fā)現(xiàn) TD 脛骨中血管生成相關(guān)蛋白、軟骨基質(zhì)蛋白及骨骼發(fā)白，包括 Runx2、Col II、BMP-2、MMP-9、Col X、Aggrecan、VEGF、HIFF、osteonectin、骨橋蛋白、TGF-β、IGF-1、EGF、TNF 等均發(fā)生了變化（劉5）。有研究表明，在 TD 期間軟骨細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)的分泌發(fā)生變化，這包括熱休克家族蛋白質(zhì)（HSPs）、Aggrecan、Col II、MMP-13 及細(xì)胞外基白酶誘導(dǎo)因子等（田文霞 2007）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2593929