【摘要】：傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的禽類的一種急性、高度接觸性傳染病,是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重大傳染病之一。IBV是禽類一種變異性很強的冠狀病毒,傳播迅速、血清型眾多,不同的血清型之間缺乏交叉保護。IBV的蔓延對全球家禽業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。N蛋白是誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答的重要免疫原蛋白,N基因具有高度的保守性。本研究以IBV N蛋白為研究對象,制備了針對N蛋白的單克隆抗體,對IBV的預(yù)防、診斷及控制具有一定的意義。本實驗將IBV H120毒株通過接種雞胚的方法擴繁,從含病毒的尿囊液中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計一對特異性引物對N基因進行擴增,片段大小為1230bp,將其與克隆載體pMD19-T連接并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞并保存菌種,將其與表達載體pGEX-6p-1連接并轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)感受態(tài)細胞,進行誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE電泳分析重組N蛋白大小約為79kD,用GST柱純化重組N蛋白,加入PreScission Protease切除GST標(biāo)簽,Western-blot檢測N蛋白的抗原性,結(jié)果顯示N蛋白有較好的抗原性。采用純化的N蛋白對BALB/c小鼠進行免疫,通過間接ELISA方法檢測,選取免疫效果最好的小鼠B淋巴細胞進行細胞融合。通過間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞,經(jīng)過三輪亞克隆獲得了13株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白抗體的雜交瘤細胞株,其中8株能與IBV結(jié)合。選擇效價高且能與IBV結(jié)合的1A12C5細胞株,通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗N蛋白的單克隆抗體,收集腹水用正辛酸-硫酸銨法對其進行純化,SDS-PAGE電泳結(jié)果表明該單抗純度比較高。1A12C5單克隆抗體重鏈為IgG2b,輕鏈κ型。純化后的1A12C5單抗效價可以達到1:1.64×10~6,親和力常數(shù)為1.87×10~7 L/mol。特異性鑒定結(jié)果表明1A12C5僅與IBV特異性結(jié)合。1A12C5單克隆抗體能與不同血清型的IBV反應(yīng)。穩(wěn)定性鑒定表明1A12C5單克隆抗體具有良好的傳代穩(wěn)定性。本試驗成功制備了13株抗IBV N蛋白單克隆抗體其中8株可以與IBV結(jié)合,為進一步研制IBV診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 OIE 公布的 IBV 全球分布圖BV 的病原學(xué)概述IBV 的分類地位V 是套式病毒目(Nidovriales)冠狀病毒科(Coronavridae)冠狀病毒亞科(virinae)γ 冠狀病毒屬(Coronavrius)成員[12]。冠狀病毒科包含凸隆病毒屬毒屬，根據(jù)血清學(xué)和遺傳學(xué)的差異能夠把冠狀病毒屬劃為三個群，IBV群的禽冠狀病毒的代表成員[13, 14]。IBV 的結(jié)構(gòu)特征V 主要包含囊膜以及核衣殼。囊膜為脂質(zhì)雙分子層，位于病毒的最外面由宿主細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)中的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體膜組成的。IBV 是的，由單股的正鏈 RNA 組成基因組，總長大概是 27.6kb[15]。病毒體為螺旋對稱，半徑大約為 40~60nm。IBV 內(nèi)部是蛋白質(zhì)以及 RNA 構(gòu)成螺

圖 1.2 IBV 結(jié)構(gòu)模式圖特征環(huán)境抵抗力較弱，大部分毒株在 56℃條去活性，，可以通過 20%馬血清或者 lm。不同毒株可能有一定差異，2M MgCl2不耐堿耐酸，于pH6.0~6.5環(huán)境進行培養(yǎng)性[17]。組織被病毒感染后可以在含 50%凍就能夠送到相關(guān)實驗室檢測診斷。含℃~-80℃條件下保存多年 IBV 依然可以以及干燥有穩(wěn)定效果，凍干毒能夠在低特性有血凝性，但是通過一些處理會導(dǎo)致血
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2593774