【摘要】：泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,在真核生物細(xì)胞中廣泛存在,參與蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等多種細(xì)胞進(jìn)程。許多病毒也編碼泛素系統(tǒng)中的一些組分,形成了擾亂和操縱宿主細(xì)胞泛素系統(tǒng)的多種機(jī)制。有研究報(bào)道,雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV)ORF150編碼一種E3泛素連接酶類似物,屬于N1R/p28基因家族,該家族基因編碼蛋白一般都含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(KilA-N)和環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING finger),具有E3泛素連接酶活性。RING型泛素連接酶一般都具有調(diào)控自身泛素化的特點(diǎn),為研究ORF150編碼蛋白是否也受到自身泛素化的調(diào)控,本研究構(gòu)建了ORF150和Ub的真核表達(dá)載體,通過(guò)免疫共沉淀證明了FPV150蛋白可以發(fā)生泛素化修飾;在LMH細(xì)胞和293T細(xì)胞中進(jìn)行的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:FPV150蛋白和Ub共同表達(dá)后亞細(xì)胞定位都發(fā)生了改變,兩者均由散在分布變?yōu)榫奂诩?xì)胞核周圍成團(tuán)分布,且發(fā)生了共定位。為探索FPV ORF150的基因功能,本研究構(gòu)建了ORF150基因缺失重組病毒。首先利用同源重組和蝕斑純化的方法在雞胚成纖維細(xì)胞(Chick Embryo Fibroblast,CEF)上構(gòu)建和篩選了一株用報(bào)告基因EGFP替換FPV NX10毒株ORF150基因的重組病毒r FPV-Δ150-EGFP,然后利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了重組病毒r FPV-Δ150-EGFP中EGFP基因的敲除,得到了不帶篩選標(biāo)記的FPV ORF150基因缺失重組病毒r FPV-Δ150。取r FPV-Δ150-EGFP和r FPV-Δ150的F3代測(cè)定一步生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示r FPV-Δ150-EGFP F3和r FPV-Δ150 F3與各自的親本病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)基本一致。將r FPV-Δ150-EGFP、rFPV-Δ150和FPV NX10在CEF上連續(xù)傳代,分別通過(guò)熒光觀察、PCR、Western blot和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定鑒定重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。r FPV-Δ150-EGFP F6代之后隨著病變減少,熒光減少;r FPV-Δ150在F5代后也出現(xiàn)病變顯著減少的現(xiàn)象,而野生型病毒未見此現(xiàn)象。PCR鑒定和Western blot檢測(cè)的結(jié)果表明重組病毒r FPV-Δ150-EGFP在傳代過(guò)程中未發(fā)生EGFP基因的丟失,也無(wú)野生型病毒的存在;r FPV-Δ150在傳代過(guò)程中無(wú)親本病毒或野生型病毒的存在。r FPV-Δ150-EGFP F5和r FPV-Δ150 F5與野生型病毒FPV NX10的復(fù)制動(dòng)力學(xué)基本一致。利用篩選的重組病毒r FPV-Δ150 F3代,在CEF細(xì)胞上研究FPV150蛋白與宿主Ub的相互作用。一方面利用熒光定量PCR技術(shù),分析FPV NX10和r FPV-Δ150接種細(xì)胞后1~23 h(每2 h間隔取樣)內(nèi)源性Ub轉(zhuǎn)錄水平的差異,結(jié)果顯示:在大部分觀測(cè)點(diǎn),接種r FPV-Δ150組Ub的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平高于FPV NX10組,在3 h、7 h和21 h時(shí)差異顯著(p0.05),在17 h、19 h和23h時(shí)差異極顯著(p0.01),FPV NX10和r FPV-Δ150分別在感染細(xì)胞后19 h和15 h引起細(xì)胞的Ub轉(zhuǎn)錄水平大幅升高,說(shuō)明FP V在完成一個(gè)復(fù)制周期之后大量繁殖促進(jìn)Ub轉(zhuǎn)錄。另一方面通過(guò)蝕斑測(cè)定,分析Ub的過(guò)表達(dá)對(duì)FPV NX10和r FPV-Δ150病毒效價(jià)的影響。結(jié)果表明,在不影響細(xì)胞活性的情況下,Ub的過(guò)表達(dá)能夠使FPV NX10的病毒效價(jià)升高,使r FPV-Δ150的病毒效價(jià)降低。說(shuō)明FPV150蛋白通過(guò)與Ub相互作用促進(jìn)病毒復(fù)制。本研究對(duì)FPV150蛋白和Ub的相互作用進(jìn)行了初步研究,為雞痘病毒泛素系統(tǒng)相關(guān)基因的功能解析及其與病毒復(fù)制之間的關(guān)系的深入研究提供實(shí)驗(yàn)思路。
【圖文】：

的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至兩種細(xì)GGS-150-Flag 和 pCAGGS，用 PBS 沖洗 2 次，每皿每皿加入 1 mL 0.1% Trito，室溫封閉 1 h；加入 1%達(dá)，，Mouse anti-Ub (P4D1PBST 洗 4 次，每次 10 min Invitrogen Goat anti-MousST 洗 4 次，每次 10 min；可用激光共聚焦掃描顯微鏡構(gòu)建與鑒定bp M 1 2

M 1：DL2000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；M 2：DL15000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pEASY-blunt-150 的 PCR 鑒定 2：空白對(duì)照 3：pEASY-blunt-150 EcoRⅠ單酶切；4：pEASY-blunt-150 EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切M 1: DL2000 DNA M arker; M 2: DL15000 DNA M arker; 1: Identification of pEASY-blunt-150 by PCR; 2: Blank control;3: Products from the pEASY-blunt-150 digested with EcoRⅠ; 4: Products from the pEASY-blunt-150 digested withEcoRⅠ and XhoⅠ圖 2.2 重組克隆質(zhì)粒 pEASY-blunt-150 的 PCR 和酶切鑒定Figure 2.2 PCR identification and restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pEASY-blunt-1502.3.1.3 pEASY-blunt-150 的測(cè)序結(jié)果質(zhì)粒送博仕生物公司測(cè)序后，用 DNAMAN 進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示克隆片段與實(shí)驗(yàn)室之前獲得的 FPV NX10 毒株 ORF150 基因序列相似性為 100%（圖 2.3），與預(yù)期相符，可用于后續(xù)表達(dá)載體的構(gòu)建。劃線部分為引物位置。100075075005000500025001000250
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2593536