【摘要】：腺病毒是一種常用的研制重組病毒的載體,國內外目前研究比較深入的是人和哺乳動物腺病毒載體,而對于禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)作為載體的研究較少。本研究擬分離鑒定血清1型禽腺病毒(FAdV-1),并對其進行生物學特性研究,為進一步研制以FAdV為載體的重組病毒疫苗奠定基礎。此外,還制備針對FAdV-1的單克隆抗體,為建立檢測FAdV-1的方法提供基礎材料。1.血清1型禽腺病毒的分離鑒定及生物學特性分析本研究從健康雞群采集泄殖腔拭子,以FAdV通用引物Hex-F1/R1進行PCR檢測。陽性樣品經絨毛尿囊膜接種雞胚分離病毒,病毒在雞肝癌細胞系(LMH)上增殖培養(yǎng),直至產生穩(wěn)定細胞病變。在LMH細胞上增殖的病毒經空斑純化,PCR鑒定并測序,序列經比對分析確定病毒血清型,然后進行生物學特性分析。我們從50份樣品中分離到一株FAdV-1,命名為FAdV-1 JS2017。病毒在LMH上可以產生細胞變圓,折光性增強的典型FAdV細胞病變。進一步用SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測病毒滴度為6.34×107copies。經電鏡觀察病毒粒子為球型、無囊膜,直徑為70～90 nm。設計34對引物,對JS2017全基因組序列進行擴增、測定及生物信息學分析,JS2017基因組全長為43739 bp,G+C含量為54.29%,包括34個ORF編碼區(qū),含有54 nt的末端倒置重復序列(ITR)。JS2017與FAdV-1參考毒株CELO株、61/11Z株、JM1/1株、W-15株同屬一個大的進化分支,核苷酸序列同源性分別為99.3%、99.7%、99.3%、99.6%。一周齡SPF雞通過肌肉注射106.86TCID50 JS2017病毒液進行人工致病性試驗,試驗雞未出現(xiàn)任何明顯臨床癥狀。感染10d后進行剖檢,喉頭、氣管、心臟、肝臟、肌胃、腎臟等內臟器官未發(fā)現(xiàn)肉眼可見病變。組織病理學切片觀察發(fā)現(xiàn)各臟器組織結構無明顯異常。排毒檢測結果表明,感染7d達到排毒高峰,并且在肝臟、腎臟中也能夠檢測到病毒。這些結果表明FAdV-1 JS2017株無致病性,復制能力強。在FAdV-1 JS2017株基因組右末端40000 bp～43620 bp的復制非必需區(qū)兩端設計引物擴增同源臂,通過帶有同源臂序列和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的轉移質粒pFAd1-EGFP與FAdV-1 JS2017株在LMH細胞內同源重組,缺失掉同源臂序列之間的復制非必需區(qū)而替換為EGFP基因的完整表達盒。FAdV-1 JS2017株感染LMH細胞2h后,轉移載體pFAd1-EGFP通過脂質體轉染的方法轉染LMH細胞,并用空斑純化的方法純化重組病毒,成功獲得了一株穩(wěn)定表達EGFP的重組病毒FAd1-EGFP,該結果表明缺失FAdV-1 JS2017株基因組右末端復制非必需區(qū),不影響其在LMH細胞上的穩(wěn)定復制,為進一步研制以FAdV為載體的重組病毒疫苗奠定基礎。2.FAdV-1單克隆抗體的制備在LMH細胞上增殖FAdV-1JS2017,收取病毒液,初步純化后免疫BALB/c小鼠。抗體效價達到1:25600,取免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)融合。JS2017病毒液經超速離心純化后作為抗原包被酶標板,利用建立的間接ELISA方法進行雜交瘤細胞的篩選及亞克隆后雜交瘤細胞的檢測,獲得9株針對FAdV-1的雜交瘤細胞株。用原核表達的FAdV-1六鄰體蛋白作為抗原包被酶標板,對9株雜交瘤細胞株進行鑒定,得到5株針對FAdV-1六鄰體蛋白能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為2D11、3C7、6G8、9D6、12H7。進一步經純化的FAdV-4和FAdV-8b分別作為抗原,通過間接ELISA、間接免疫熒光試驗、Westem-blot對上述5株雜交瘤細胞株進行鑒定,結果顯示6G8和9D6能夠與FAd V-4和FAdV-8b發(fā)生特異性反應。本研究獲得5株能穩(wěn)定分泌抗FAdV-1六鄰體蛋白的單克隆抗體,其中6G8和9D6同時與FAdV-1、FAdV-4和FAdV-8b發(fā)生特異性反應,這些單抗為以后建立檢測FAdV-1的方法提供基礎材料。
【圖文】：

邐Ｘｔ—Ｎｏｔｌ逡逑、ＸｈｏＩ逡逑圖１－２轉移載體ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ結構示意圖逡逑Ｆｉｇ．１－２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑

邐Ｍ邋ＤＯＷＮ逡逑￣＾０１逡逑圖１－１轉移載體Ｐ－ＵＤ的示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐ－ＵＤ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑２．４．１．３．３質粒ｐ－ＵＤ的酶切鑒定逡逑質粒ｐ－ＵＤ分別用／／／ｗ／ＩＩＩ、Ｉ和ＡＷ邋Ｉ、Ｉ進行雙酶切，然后經１％瓊脂糖凝膠逡逑電泳進行鑒定，與凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。逡逑２．４．２轉移載體ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ的構建及鑒定逡逑２．４．２．１轉移載體ｐＦＡｄｌ－ＥＧＦＰ的構建逡逑將雙酶切鑒定正確的ｐ－ＵＤ和ｐＢ－ＥＧＦＰ邋（本實驗室保存）經Ａ／0／Ｉ邐限制性內切逡逑酶分別進行雙酶切，３７°Ｃ水浴鍋中反應１邋ｈ，，邋１％凝膠電泳后切膠回收。將回收的ｉＶｏ／１－ＥＧＦＰ－逡逑Ａｒ丨１片段，與線性化載體ｐ－ＵＤ用Ｔ４邋ＤＮＡ連接酶２５°Ｃ連接２邋ｈ。取連接產物轉化至Ｔｒａｎｓ－逡逑Ｔ１感受態(tài)細胞，涂Ａｍｐ＋板子，３７°Ｃ培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。挑取５個單菌落分別接種予５逡逑ｍＬ含Ａｍｐ＋的ＬＢ液體培養(yǎng)基中，２２０邋ｒ／ｍｉｎ，３７°Ｃ搖床振蕩過夜。以ＣＭＶ－Ｆ、ＢＧＨ－Ｒ為逡逑引物，菌液ＰＣＲ鑒定陽性克隆。鑒定正確的陽性菌液按丨：１００的比例接種于１５邋ｍＬ含有逡逑Ａｍｐ＋的ＬＢ液體培養(yǎng)基中
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 高倩;江洪;葉茂;郭文娟;;全球單克隆抗體藥物研發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J];中國生物工程雜志;2019年03期

2 杜鈺瀟;;單克隆抗體的發(fā)展與應用[J];中國新通信;2019年08期

3 李忠元;;治療性單克隆抗體藥物與臨床檢驗[J];海峽藥學;2017年09期

4 李忠元;;治療性單克隆抗體藥物與臨床檢驗[J];海峽藥學;2017年10期

5 關錄凡;李鄭武;袁淑杰;高晶;;貝伐珠單抗研究現(xiàn)狀及臨床應用[J];科學中國人;2016年35期

6 李婷婷;崔慧斐;;兔單克隆抗體的發(fā)展及應用前景[J];食品與藥品;2012年09期

7 范娜娜;丁倩;趙田田;詹金彪;;單克隆抗體藥物與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療[J];中國細胞生物學學報;2011年09期

8 任會琴;張永莉;吳劍涓;閻維維;;單克隆抗體藥物在抗血栓治療中的應用及研究進展[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2010年09期

9 孟凡信,文昭明;抗IgE單克隆抗體——呼吸道變態(tài)反應性疾病治療的革新[J];中國醫(yī)院用藥評價與分析;2004年05期

10 羅萍,鄒全明,王曉勤,馬穎;抗重組人表皮生長因子單克隆抗體的制備及生物學特性鑒定[J];微生物學雜志;2004年05期

相關會議論文 前10條

1 王暉;陳熙;彭曉云;;使用Waters UPLCI-Class Xevo TQ-S液質聯(lián)用系統(tǒng)建立并驗證單克隆抗體英夫利昔的生物定量分析方法[A];2015年（第五屆）藥物毒理學年會論文集[C];2015年

2 劉大維;高斌;;狂犬病毒單克隆抗體的研制[A];2010年中國科學院微生物研究所博士后學術年會暨第二屆博誼論壇論文摘要集[C];2011年

3 張光波;董秋明;於葛華;李文香;張學光;;一株鼠抗人4-1BB單克隆抗體的研制及其生物學功能的鑒定[A];第六屆全國免疫學學術大會論文集[C];2008年

4 劉健宏;王標;莊向生;王長兵;周倫江;劉玉濤;;單克隆抗體與免疫熒光染色技術[A];福建省科協(xié)首屆學術年會衛(wèi)星會議——畜牧業(yè)持續(xù)發(fā)展對策學術研討會論文集[C];2001年

5 耿s

本文編號：2593310