【摘要】：禽呼腸孤病毒(ARV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)分支的重要成員,感染宿主常為雞、番鴨及一些鳥類,常見臨床病癥有吸收不良綜合征、病毒性關(guān)節(jié)炎以及免疫抑制性疾病。ARV危害嚴(yán)重,給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn),ARV可以在雞肝癌(LMH)細(xì)胞系、綠猴腎(Vero)細(xì)胞系、雞胚成纖維(DF-1)細(xì)胞系等多種細(xì)胞系中進(jìn)行增殖,但有關(guān)于其增殖規(guī)律的研究尚未見報(bào)道。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是基因工程的四大表達(dá)系統(tǒng)之一,其具有外源基因表達(dá)量高、可攜帶較大的基因片段、表達(dá)產(chǎn)物生物活性好等多種優(yōu)勢(shì)。ARV編碼的σB、σC蛋白是其病毒粒子的外衣殼蛋白,σB蛋白攜帶有群特異型中和抗原決定簇,σB蛋白通過σC蛋白作用,提高ARV感染細(xì)胞的能力。σC蛋白攜帶有ARV特異性中和反應(yīng)的表面抗原,能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體,并與病毒粒子的吸附、增殖等過程有關(guān)。因此,σB蛋白和σC蛋白是研制ARV疫苗的首選蛋白。為此,本課題首先研究了 ARV在幾種細(xì)胞系中的增殖特性,隨后通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ARVσB、σC抗原蛋白,并分析其生物學(xué)活性。以期為ARV的防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。本研究結(jié)果主要分為四部分。1.ARV增殖特性的研究將ARVS1133毒株梯度稀釋接種雞肝癌(LMH)細(xì)胞系、非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞系和雞胚成纖維(DF-1)細(xì)胞系,分別測(cè)定ARV感染三種細(xì)胞系后八個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h)的病毒滴度,并繪制ARV在三種細(xì)胞系上的生長(zhǎng)曲線,分析其增殖規(guī)律。結(jié)果顯示,ARV在Vero細(xì)胞系上增殖更快,病毒滴度更高,穩(wěn)定期更長(zhǎng),更適合ARV的增殖。同時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的CPE,且在感染后48 h達(dá)到病毒滴度峰值,為1×10-8 46/0 1 mL。2.構(gòu)建ARV σB、σC基因的表達(dá)載體分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中σB、σC基因與表達(dá)載體序列特征,設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增σB、σC基因并構(gòu)建其重組表達(dá)載體,命名為σB-pFastHTB、σC-pFast Dual,對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果顯示,成功擴(kuò)增了σB、σC全長(zhǎng)基因,并克隆至表達(dá)載體上,構(gòu)建了σB、σC基因的重組表達(dá)載體。3.σB、σC蛋白在Sf9細(xì)胞中的可溶性表達(dá)將σB、σC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,提取重組桿粒后分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,獲得了其重組桿狀病毒,命名為BacSC-σB、BacSC-σC。并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、DNA水平驗(yàn)證以及mRNA轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證,同時(shí)測(cè)定其病毒滴度。研究結(jié)果表明BacSC-σB、BacSC-σC成功感染Sf9細(xì)胞,且轉(zhuǎn)染后的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)胞核變大,胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)等典型CPE,重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后的DNA提取物及RNA提取物均能檢出目的片段大小的條帶,BacSC-σB 的 TCIDso 為 10-9 42/0.1 mL、BacSC-σC 的 TCID50 為 10-8 31/0.1 mL。4.σB、σC蛋白的初步驗(yàn)證提取重組蛋白,命名為rBacSC-σB、rBacSC-σC,對(duì)重組蛋白進(jìn)行IFA、SDS-PAGE及Western Blot初步驗(yàn)證。結(jié)果表明:σB、σC蛋白成功在Sf9細(xì)胞中表達(dá);IFA結(jié)果顯示重組桿狀病毒BacSC-σB、BacSC-σC感染的Sf9細(xì)胞均出現(xiàn)綠色熒光;SDS-PAGE、Western Blot結(jié)果顯示rBacSC-σB在41kD處有蛋白條帶,rBacSC-σC在35kDa處有蛋白條帶,表明σB、σC重組蛋白成功在Sf9細(xì)胞中表達(dá),且能與ARV陽性血清抗體反應(yīng),表現(xiàn)出較好的反應(yīng)原性。本研究獲得了 ARV在幾種細(xì)胞系中的增殖規(guī)律資料,完成了在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中σB、σC蛋白的表達(dá)與鑒定,為下一步ARV疫苗的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與技術(shù)支撐。
【圖文】：

圖１－１邋ＡＲＶ結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｎ邋ＡＲＶａｒｔｉｃｌｅ逡逑

洌媯媯隆ⅲǎ罰沒餉蛟詬俗床《鞠低持斜澩锏難芯浚]3?ＬＭＨ、Ｖｅｒｏ、ＤＦ－１細(xì)胞感染ＡＲＶ后均出現(xiàn)了細(xì)胞破碎、脫落、萎縮、邊緣模糊等ＣＰＥ，，逡逑對(duì)照組的細(xì)胞均生長(zhǎng)良好。ＣＰＥ結(jié)果見圖２－１、２－２、２－３。逡逑■■ＭＭ逡逑圖２－１正常ＬＭＨ細(xì)胞（Ａ）與ＡＲＶＳ１１３３感染的ＬＭＨ細(xì)胞（Ｃ－Ｄ）邐（４００Ｘ）逡逑Ａ：正常的ＬＭＨ細(xì)胞形態(tài)；Ｂ：接毒２４ｈ的ＬＭＨ細(xì)胞形態(tài)；Ｃ：接毒４８ｈ的ＬＭＨ細(xì)胞形態(tài)；Ｄ：接逡逑毒７２邋ｈ的ＬＭＨ細(xì)胞形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｎｏｒｍａｌ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌｓ（Ａ）邋ａｎｄ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＡＲＶ邋ＳＩ邋１３３邋（Ｃ－Ｄ）邐（４００Ｘ）逡逑Ａ：邋Ｎｏｒｎｉａｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ｏｆ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ；邋Ｂ：邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ａｔ邋ｈｏｕｒ邋２４邋ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；邋Ｃ：邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ａｔ邋ｈｏｕｒ逡逑４８邋ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；邋Ｄ：邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ａｔ邋ｈｏｕｒ邋７２邋ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑■■■逡逑圖２－２正常NB６１＇0細(xì)胞（八）與八１＾／５丨１３３感染的NB￡１＇0細(xì)胞（（：－０）邐（４００Ｘ）逡逑Ａ：正常的Ｖｅｒｏ細(xì)胞形態(tài)；Ｂ：接毒２４ｈ的Ｖｅｒｏ細(xì)胞形態(tài)；Ｃ：接毒４８ｈ的Ｖｅｒｏ細(xì)胞形態(tài)；Ｄ：接毒逡逑７２邋ｈ的Ｖｅ
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Zhihong Huang;Ao Li;Mengjia Pan;Wenbi Wu;Meijin Yuan;Kai Yang;;Introduction of temperature-sensitive helper and donor plasmids into Bac-to-Bac baculovirus expression systems[J];Virologica Sinica;2015年05期

2 丁明洋;畢莊莉;朱英奇;戚偉強(qiáng);朱杰;宋凱杰;陳宗艷;李傳峰;吳潤(rùn);劉光清;;新型鴨呼腸孤病毒TH11株在BHK21細(xì)胞系中的增殖特性[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2015年09期

3 王盛;謝芝勛;黃莉;謝麗基;鄧顯文;謝志勤;劉加波;羅思思;曾婷婷;;禽呼腸孤病毒σ3基因在煙草中的表達(dá)與鑒定[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年09期

4 凌同;余黎;白慕群;;昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展與應(yīng)用[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2014年02期

5 吳曉平;張紅星;吳異健;韓典霖;王劭;吳寶成;黃一帆;;番鴨呼腸孤病毒YB株σB蛋白的基因序列分析及其原核表達(dá)[J];病毒學(xué)報(bào);2013年02期

6 謝志勤;謝芝勛;劉加波;龐耀珊;鄧顯文;謝麗基;彭宜;范晴;;重組禽呼腸孤病毒S1133σ3基因表達(dá)及其免疫原性研究[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年08期

7 鐘澤{

本文編號(hào)：2592787