發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 07:16

【摘要】：雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis,IB)是一種有重大經(jīng)濟(jì)影響且呈全球分布的家禽疾病。它由雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起,是危害我國養(yǎng)禽業(yè)健康養(yǎng)殖的重要疫病。目前已有多種商品化疫苗用于IB的免疫預(yù)防,但由于IBV的高變異性、不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)等原因,IB并未得到有效控制,IBV的綜合防控仍然存在著大量難題。鑒于此,本研究對(duì)流行病學(xué)檢測(cè)陽性樣品進(jìn)行IBV野毒株分離鑒定及其主要蛋白遺傳變異性分析;并基于分離毒株建立IBV快速檢測(cè)方法,包括熒光定量PCR檢測(cè)方法和間接ELISA抗體檢測(cè)方法,利用建立的檢測(cè)方法對(duì)山東地區(qū)開展流行病學(xué)調(diào)查;對(duì)分離鑒定的部分毒株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化,確立最佳培養(yǎng)方法;利用細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液配制滅活疫苗,探討滅活疫苗的免疫效果,以期為IBV的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查、致病機(jī)制研究、遺傳變異趨勢(shì)研究、疫苗的制備和檢驗(yàn)技術(shù)研究奠定基礎(chǔ),為山東地區(qū)IBV綜合防控措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。為對(duì)山東地區(qū)疑似IBV感染臨床病例進(jìn)行病原的分離與鑒定,并掌握分離毒株的生物學(xué)特性和遺傳特征,本研究進(jìn)行了病毒分離、血凝實(shí)驗(yàn)、雞胚致病性、動(dòng)物回歸等系列試驗(yàn)。結(jié)果共獲得分離毒株48株,對(duì)SPF雞胚的EID50為10-5.0/0.1m L~10-5.83/0.1 m L,均能引起SPF雛雞表現(xiàn)典型的IBV感染癥狀,對(duì)SPF雛雞的致死性介于30%~60%,遺傳進(jìn)化分析顯示48株分離毒株中有46株QX基因型,2株Mass基因型,表明QX基因型已成為山東地區(qū)IBV流行的優(yōu)勢(shì)基因型。基于分離QX基因型毒株建立IBV熒光定量PCR檢測(cè)方法并組裝試劑盒,檢測(cè)分離毒株的器官嗜性和疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn)的排毒量,同時(shí)為IBV感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供新的檢測(cè)方法。結(jié)果顯示:該檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2為0.9988,可檢測(cè)到7.5×103 copies/μL的病毒核酸,比常規(guī)RT-PCR的敏感性高100倍;特異性檢測(cè)結(jié)果顯示檢測(cè)MDV、NDV、IBDV、ILTV等其他禽源類病毒均為陰性;批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于3%;利用該試劑盒檢測(cè)192份臨床送檢病料,檢測(cè)出陽性樣品48份,陽性率達(dá)25.0%(48/192),顯著高于普通PCR檢測(cè)方法。以上結(jié)果表明IBV Real-time PCR試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好,可用于IBV的定量檢測(cè)和IBV感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。參照IBV S1基因序列,RT-PCR擴(kuò)增分離毒株長約867 bp的S1基因主要抗原區(qū)域,將其克隆到p ET30α原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化Rossetta表達(dá)菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了以包涵體形式表達(dá)的IBV重組S1蛋白。在此基礎(chǔ)上,將S1重組蛋白經(jīng)純化后作為抗原,建立了IBV間接ELISA抗體檢測(cè)方法并組裝了試劑盒,該試劑盒相對(duì)于IDEXX ELISA試劑盒的符合率、敏感性、特異性分別為94.55%,95.42%和92.96%,為后續(xù)疫苗抗體檢測(cè)提供了技術(shù)支持,同時(shí)為臨床野毒感染快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供新的血清學(xué)診斷技術(shù)。為了確定分離毒株適于增殖的細(xì)胞系,本研究首先將IBV GQ/2015株、WF/2015株、M41株與M491株分別接種Vero、Vero-E6、BHK-21、Macr-145與DF-1細(xì)胞,并盲傳至F5代,通過EID50的測(cè)定,確定最佳細(xì)胞系及其最適毒株;在此基礎(chǔ)上,對(duì)細(xì)胞密度、增殖曲線等培養(yǎng)條件、病毒增殖促進(jìn)劑的作用及小型生物反應(yīng)器的應(yīng)用進(jìn)行了探索。結(jié)果顯示,5種細(xì)胞中,僅Vero細(xì)胞適于4株IBV的增殖培養(yǎng),且GQ/2015株與M491株增殖效果最佳,其毒價(jià)分別為10-4.83/0.1 m L與10-4.5/0.1 m L;而Marc-145、BHK-21與DF-1細(xì)胞只適于IBV某個(gè)毒株的增殖,且其毒價(jià)顯著低于Vero細(xì)胞培養(yǎng)物。另一方面,對(duì)GQ/2015株與M491株增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化的研究顯示,GQ/2015株與M491株最適接毒量為細(xì)胞培養(yǎng)液的1%、最佳血清濃度為2%、最適接毒方式為分步接毒、最佳收毒時(shí)間為60 h~72 h。最后應(yīng)用固定床紙片載體生物反應(yīng)器對(duì)GQ/2015與M491株進(jìn)行增殖培養(yǎng),結(jié)果顯示,GQ/2015株與M491株的EID50可顯著提高至10-6.375/0.1 m L與10-5.83/0.1 m L。因此本研究必將為實(shí)現(xiàn)應(yīng)用細(xì)胞系增殖培養(yǎng)IBV的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。為開發(fā)針對(duì)IBV流行毒株的新型疫苗,本研究以IBV GQ/2015株為疫苗株,采用細(xì)胞培養(yǎng)方法制備病毒液,以白油為佐劑,研制了IBV油乳劑滅活疫苗,該疫苗安全性好;疫苗免疫0.1 m L和0.3 m L后21 d間接ELISA抗體水平(S/P值)達(dá)到峰值,免疫0.5 m L后30 d間接ELISA抗體水平(S/P值)達(dá)到峰值;不同分離毒株交叉保護(hù)性試驗(yàn)顯示該滅活疫苗對(duì)當(dāng)前流行的IBV毒株具有非常好的交叉保護(hù)效果。表明IBV GQ/2015株油乳劑滅活疫苗具有良好的安全性和免疫原性,為研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的針對(duì)流行毒株的IBV疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 分離毒株雞胚胚體病變圖片F(xiàn)ig3.1 Image separation of embryo somatic lesions in chicken embryoA. GQ/2015 株；B. WF/2015 株；C. LY/2014 株；D. QD/2015 株；6. HZ/2016 株A. GQ/2015 strain；B. WF/2015 strain；C. LY/2014 strain；D. QD/2015 strain；6. HZ/2016 strain1.2.3 分離毒株毒價(jià)（EID50）測(cè)定結(jié)果將48個(gè)分離毒株的第6代雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-63個(gè)稀釋度分別接種10日齡SPF雞胚5枚，0.1mL/胚，37 ℃孵育觀察至144 h，，解剖觀察雞胚病變情況，按Reed-Muench法計(jì)算分離病毒的EID50，結(jié)果如表1.2所示。E

攻毒雞部分器官病變圖片
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2592978