【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)廣泛流行于我國,嚴(yán)重威脅著家禽的健康。我國20世紀(jì)末就開始使用H9N2亞型AIV滅活疫苗。然而,一旦H9N2亞型AIV抗原發(fā)生變異或重組,現(xiàn)有疫苗與新毒株抗原性不匹配,就需要篩選新的疫苗株,這個過程耗時費(fèi)力,且?guī)缀趺扛?-5年就需要更新疫苗。因此具有交叉保護(hù)效果的通用疫苗的開發(fā)成為目前流感疫苗研究的一個熱點(diǎn),例如設(shè)計(jì)針對流感病毒保守區(qū)域的疫苗、馬賽克(Mosaic)疫苗等。Mosaic序列是在不改變目標(biāo)蛋白長度和特性的前提下,將已有的目標(biāo)蛋白序列中含有的抗原表位鑲嵌組合成的新序列,使其包含更多的來自已有序列的潛在T細(xì)胞抗原表位。Mosaic序列的設(shè)計(jì)是利用已有蛋白質(zhì)的片段使用遺傳算法(計(jì)算優(yōu)化方法)進(jìn)行組裝,產(chǎn)生的序列類似于已有序列。依據(jù)Mosaic序列設(shè)計(jì)的艾滋病毒疫苗、H5亞型禽流感病毒疫苗等均獲得較好的通用保護(hù)效果。本論文初步研究了Mosaic序列在H9亞型禽流感病毒滅活疫苗中的應(yīng)用效果。一、H9 AIV的馬賽克HA序列(HAm/H9)設(shè)計(jì)與分析設(shè)計(jì)合成了一條H9N2 AIV的HA蛋白馬賽克序列(HAm/H9)。對HAm/H9進(jìn)行了抗原表位覆蓋率分析;選取處于不同進(jìn)化分支的H9N2 AIV分離株的HA蛋白序列,與HAm/H9序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化和同源性分析,預(yù)測了HAm/H9的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位。結(jié)果表明,HAm/H9蛋白序列具有較好的潛在抗原表位覆蓋率;其屬于Y280這一分支,與其他毒株的同源性范圍為86%-100%;HAm/H9的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位多于其他比對毒株。二、表達(dá)HAm/H9蛋白的重組H9N1 AIV的拯救以H1N1流感病毒PR8株為骨架,采用反向遺傳操作技術(shù),以HAm/H9序列替換PR8株的HA序列,構(gòu)建獲得HAm/H9的表達(dá)質(zhì)粒PHW2000-HAm/H9。采用“7+1”反向遺傳操作,將PHW2000-HAm/H9與表達(dá)PR8其他7個基因的表達(dá)質(zhì)粒(除HA外)共轉(zhuǎn)染293T和MDCK混養(yǎng)細(xì)胞中,拯救并獲得了重組H9N1亞型禽流感病毒株rPR8-HAm/H9。測定了重組病毒和親本PR8株在BHK-21細(xì)胞的生長曲線,結(jié)果表明兩株病毒的增殖滴度相近,HA基因的替換未改變病毒的增殖特性。三、重組病毒對H9N2 AIV的免疫保護(hù)效果將感染有重組H9N1病毒株rPR8-HAm/H9的雞胚尿囊液以0.1%的甲醛滅活,制備滅活疫苗,經(jīng)疫苗的穩(wěn)定性和安全性檢驗(yàn)合格后,開展了其在雞體上對H9N2AIV地方分離株JM0305株的免疫保護(hù)效果。同時設(shè)置了JM0305滅活疫苗組作為陽性對照組。結(jié)果表明,rPR8-HAm/H9免疫組的雞在加強(qiáng)免疫2周后HI抗體水平達(dá)到6log_2,血清中和抗體效價為1:22;其血清抗體對JM0305也有中和效果;JM0305滅活疫苗在加強(qiáng)免疫2周后HI抗體達(dá)到6log_2,血清中和抗體效價為1:16。交叉中和試驗(yàn)結(jié)果表明,rPR8-HAm/H9免疫組的血清對JM0305有一定的中和效果。以JM0305株進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果表明,rPR8-HAm/H9免疫組對JM0305株的攻毒保護(hù)達(dá)到了80%,JM0305滅活疫苗組對JM0305的攻毒保護(hù)率為90%。排毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rPR8-HAm/H9免疫組可較好的抑制JM0305株的排毒,在攻毒后的第五天不能檢測到病毒,其結(jié)果優(yōu)于JM0305滅活疫苗對照組。綜上所述,本研究設(shè)計(jì)合成了H9N2亞型禽流感的HA馬賽克序列;以H1N1流感病毒為骨架,通過HA基因替換,獲得了表達(dá)HAm/H9蛋白的重組H9N1重組病毒株;以重組病毒制備滅活疫苗,發(fā)現(xiàn)其對H9N2禽流感病毒JM0305株具有較好的免疫保護(hù)效果,下一步將采用其他分支的H9地方分離株進(jìn)行交叉保護(hù)測定。為后續(xù)H9亞型禽流感通用疫苗的研究提供了新的思路和方法,為廣譜疫苗的研究提供了參考。
【圖文】：

描述病毒成分的甲型流感病毒示意圖

中國H9N2亞型禽流感病毒流行地理分布
【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2590818