【摘要】：水牛(Bubalus bubalis)是南亞重要的經(jīng)濟(jì)牲畜種類,具有許多良好的特性,例如耐粗飼,適應(yīng)性強(qiáng);乳品質(zhì)量高,香味濃;生長快,利用年限長;水牛肉瘦肉多,脂肪少;水牛性情溫馴,易于管理等。然而,其經(jīng)濟(jì)價(jià)值受到其低繁殖效率的限制。導(dǎo)致水牛繁殖效率低的因素很多,例如,水牛適合繁殖的年齡晚于黃牛和奶牛;雌性水牛在懷孕期間的黃體酮水平遠(yuǎn)低于黃牛;雌性水牛的發(fā)情特征不明顯,且產(chǎn)犢間隔長于黃牛和奶牛;雌性水牛對生殖激素的處理也不敏感。值得注意的是,在實(shí)驗(yàn)室條件下,從水牛卵巢收集的適合于IVM(體外成熟)的卵母細(xì)胞的數(shù)量少于黃牛和奶牛,同時(shí)在附植前胚胎發(fā)育過程中,水牛的卵裂率和囊胚率低于黃牛,這表明水牛附植前胚胎發(fā)育過程中可能存在其特有的調(diào)節(jié)機(jī)制,而在合子基因組激活之前,胚胎的早期發(fā)育主要受母源基因組的調(diào)控。哺乳動(dòng)物孤雌生殖是生殖生物學(xué)中一個(gè)重要的研究課題和研究模型,因?yàn)樗恍枰魏胃冈匆蜃拥膮⑴c,這使其成為研究母源基因組的理想模型。母源基因在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用,這需要許多基因的參與。因此,全景式地了解這些母源基因組在早期胚胎發(fā)育過程中的作用對解析母源蛋白質(zhì)或基因之間的互作關(guān)系是很有必要的。到目前為止,還沒有一個(gè)以孤雌生殖為研究模型,探索由母源基因組調(diào)控表達(dá)的蛋白質(zhì)或基因(沒有父源基因組干擾)在附植前胚胎發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)水平和轉(zhuǎn)錄組水平的動(dòng)態(tài)變化的研究報(bào)告。因此,本研究以母源基因組作為研究水牛生殖機(jī)制的切入點(diǎn),將基于串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(Tandem Mass Tag,TMT)標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)與單細(xì)胞/單胚胎的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)相結(jié)合,研究早期胚胎發(fā)育過程中母源基因組的動(dòng)態(tài)功能,為提高我們對母源基因組學(xué)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí),及改善體細(xì)胞核移植技術(shù)和孤雌胚胎干細(xì)胞技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。本文的主要研究結(jié)果如下:一、水牛卵母細(xì)胞孤雌激活前后的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。對水牛卵母細(xì)胞激活前后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)挖掘,發(fā)現(xiàn)了這些重要的差異表達(dá)蛋白質(zhì)最多涉及的是緊密連接和間隙連接等信號(hào)通路。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)驗(yàn)證和分析了 4種參與縫隙連接和緊密連接的差異表達(dá)蛋白質(zhì)(TUBB3,CTNNA1,CDH3,MAP2K1)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)規(guī)律,并且使用細(xì)胞免疫熒光對這些蛋白質(zhì)的遷移和表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析。基于這些結(jié)果,推測由母源基因組調(diào)控表達(dá)的蛋白質(zhì)在孤雌激活后可能首先在細(xì)胞連接的形成中發(fā)揮作用。二、水牛孤雌胚胎在附植前發(fā)育各個(gè)過程的單細(xì)胞/單胚胎轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),獲得和分析了胚胎發(fā)育過程中的八個(gè)階段(GV,MII,2-細(xì)胞,4-細(xì)胞,8-細(xì)胞,16-細(xì)胞,桑椹胚,囊胚)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),共有3567個(gè)基因被鑒定為在附植前發(fā)育這些所有連續(xù)階段中差異表達(dá)。同時(shí)研究還鑒定到了 10,442個(gè)新基因,并且通多對這些新基因的GO分析表明它們具有廣泛的細(xì)胞定位并參與許多分子功能和生物學(xué)過程。此外,我們確定了 8個(gè)僅在特定發(fā)育階段高度表達(dá)的聚類,并富集到了許多與特定階段相關(guān)的GO聚類和KEGG通路。此外,從母源基因組調(diào)控表達(dá)的基因網(wǎng)絡(luò)中鑒定到了 1,530個(gè)關(guān)鍵基因(hub genes),這些關(guān)鍵基因參與了 11個(gè)階段特定的模塊。使用Cytoscape 3.2.1軟件進(jìn)行可視化作圖后,獲得了這些關(guān)鍵基因的復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò),這些互作關(guān)系主要集中在MII期,4細(xì)胞,16細(xì)胞-1,16細(xì)胞-2,桑椹胚-1和囊胚階段。三、基于蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的聯(lián)合分析,對水牛母源表達(dá)蛋白質(zhì)或基因進(jìn)行了初步的篩選和鑒定。在這部分的研究中,進(jìn)行了水牛孤雌胚胎的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)聚類和相關(guān)性分析,同時(shí)結(jié)合在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中鑒定得到的NPM2(核質(zhì)蛋白質(zhì)2)和NLRP5(胚胎需要的母體抗原,也稱為Mater)在孤雌胚胎各個(gè)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化規(guī)律:即與所有其他階段相比,在GV期中的這兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)量最高,在8-細(xì)胞階段后,表達(dá)量顯著降低,并且在囊胚期中幾乎不表達(dá)。此外,分析了NPM2和Nlrp5是否具行組織表達(dá)特異性,發(fā)現(xiàn)它們僅在卵巢、MI[卵母細(xì)胞、2細(xì)胞期早期胚胎和顆粒細(xì)胞中表達(dá),進(jìn)一步說明NPM2和NLRP5可能是水牛的母源基因。基于以上結(jié)果,推測水牛孤雌生殖中可能也存在一個(gè)“母源基因組向合子基因組轉(zhuǎn)變”(MZT)的過程,并且該過程可能發(fā)生在8細(xì)胞到16細(xì)胞階段之間,這類似于正常的受精胚胎。四、為了分析研究中鑒定得到的孤雌激活后一些關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)的在不同物種之間(人、小鼠和水牛)是否具有保守性,我們使用Blast軟件進(jìn)行同源性比對,并將在水牛中鑒定得到各階段差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)的ID號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的人和小鼠的ID,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析(包括GO和KEGG等),將我們的結(jié)果擴(kuò)展到小鼠和人類。我們發(fā)現(xiàn),這些蛋白質(zhì)或基因在不同物種間進(jìn)行同源BLAST后發(fā)現(xiàn)它們顯示出較高的序列相似性,這表明在水牛母源基因組的這些發(fā)現(xiàn)將對人和小鼠的母源基因組功能的研究有比較好的參考價(jià)值。綜上所述,本研究通過使用水牛孤雌生殖為研究模型,將高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的技術(shù)體系應(yīng)用于水牛母源基因組功能的研究,為進(jìn)一步研究和篩選母源效應(yīng)基因或蛋白質(zhì)提供了豐富的數(shù)據(jù)資源,提高了我們對水牛母源基因組學(xué)在附植前胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步改善體細(xì)胞核移植和胚胎干細(xì)胞技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí),本研究的策略和方法也可為其他物種探索母源基因組的功能提供有價(jià)值的參考。
【圖文】：

１．２．１哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞孤雌激活的原理逡逑卵母細(xì)胞的化學(xué)激活方法。收集的未受精的Ｍｉｌ期的卵母細(xì)胞，此時(shí)卵母細(xì)胞將逡逑一直處于這個(gè)階段，直到來自精子或人工制劑（圖１－５）的刺激引發(fā)胞質(zhì)內(nèi)Ｃａ２＋上升和逡逑２０逡逑

它們提高了我們對母源基因組學(xué)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，，有利于改善水牛體細(xì)胞核移植逡逑技術(shù)，為孤雌胚胎干細(xì)胞的進(jìn)一步研宄奠定基礎(chǔ)。本研宄的策略對其他物種探索母源逡逑基因組功能的研究也具有參考價(jià)值。全文技術(shù)路線如圖１－７所示。逡逑水牛卵母細(xì)胞孤雌激活逡逑？＾一邋＇＾逡逑孤雌激活前后２個(gè)時(shí)期邐孤雌激活前后８個(gè)時(shí)期逡逑各時(shí)期細(xì)胞或胚胎收集逡逑蛋白質(zhì)純化邐ＲＮＡ提取逡逑ＴＵＴ標(biāo)記的定１邐單幽錄組逡逑ｓ序建庫逡逑邐邐逡逑，ｅｓｔｌｒ；ｂ，＃ｔ價(jià)＿證，信息學(xué)分ｆ互作網(wǎng)絡(luò)分析}0Ｈ疫Ｐ逡逑＊＊邐．邐（ＧＯ．邋ＫＥ６Ｇ￥）邐定位分析逡逑１邐｜逡逑蛋白盾組和轉(zhuǎn)錄組的＾＾跨物＃的同Ｓ性分析逡逑關(guān)聯(lián)比較分析逡逑數(shù)據(jù)匯總和整理逡逑圖１－７水牛孤雌生殖胚胎的多組學(xué)研究技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－７邋Ｍｕｌｔｉ－ｏｍｉｃｓ邋ｗｏｒｋｆｌｏｗｓ邋ｏｆ邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｅｍｂｒｙｏｓ逡逑５２逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823.83


本文編號(hào)：2589940