【摘要】：桿狀病毒(Baculovirus)是一類特異感染節(jié)肢動物的病原微生物,它的基因組是雙鏈超螺旋環(huán)形結(jié)構(gòu),全長約80至180 kb,通常編碼89到183個基因。DNA復(fù)制是病毒增殖周期中最重要的事件。病毒一旦感染昆蟲細(xì)胞,病毒粒子便釋放DNA進(jìn)入細(xì)胞核,病毒DNA在細(xì)胞核的病毒發(fā)生基質(zhì)內(nèi)開始復(fù)制。桿狀病毒的DNA聚合酶(DNA polymerase,DNApol)作為病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶,在細(xì)胞核內(nèi)參與了病毒的復(fù)制,但是DNApol在細(xì)胞質(zhì)翻譯后是怎樣被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核這一過程仍不清楚。本研究通過分析β桿狀病毒屬菜粉蝶顆粒體病毒(Pieris rapae granulovirus,PiraGV)DNApol的核定位信號(Nuclear localization signal,NLS),以及DNApol與宿主蛋白的相互作用,深入揭示桿狀病毒蛋白入核的分子機理。本論文研究結(jié)果如下所示:生物信息學(xué)分析顯示PiraGV N末端有一個潛在的NLS(4LFKRKLDEPPTPTHHTLVKAIKLS 25),其既不匹配于經(jīng)典單分型NLS,也沒有與二分型NLS一致性的保守序列。將PiraGV的NLS與綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)融合后能夠定位到細(xì)胞核,證實這段序列具有NLS的功能。多點突變分析證實NLS基序中的堿性氨基酸序列6KRK8以及20KAIK23對蛋白的入核是必不可少的。為了鑒定PiraGV DNApol的NLS能否替代α桿狀病毒屬斜紋夜蛾核型多角體病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)DNApol的NLS功能,將SpltNPV DNApol中的NLS替換為PiraGV DNApol NLS,構(gòu)建了質(zhì)粒pBlue-HA:Slpol~(Δnls:Prnls),將質(zhì)粒pBlue-HA:Slpol~(Δnls:Prnls)轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞,24h后免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)NLS替代的SpltNPV DNApol不能夠定位到細(xì)胞核,而是定位在細(xì)胞質(zhì)。將PiraGV DNApol NLS替代的SpltNPV dnapol轉(zhuǎn)座進(jìn)沒有dnapol的AcMNPV Bacmid中,構(gòu)建了重組病毒Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)。蛋白定位分析顯示NLS替代的SpltNPV DNApol也分布在細(xì)胞質(zhì)中。病毒增長曲線顯示在重組病毒Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞120h后病毒滴度和野生型SpltNPV DNApol重組病毒Bac-AcΔpol:Slpol相比減少了2600倍;實時定量PCR分析顯示在轉(zhuǎn)染24h后重組病毒Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)基因組的拷貝數(shù)相比Bac-AcΔpol:Slpol減少19倍;在Bac-AcΔpol:Slpol~(Δnls:Prnls)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有產(chǎn)生多角體,而Bac-AcΔpol:Slpol轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的多角體占轉(zhuǎn)染細(xì)胞總數(shù)的3.1%。這些結(jié)果證實在SpltNPV DNApol中NLS的替換導(dǎo)致了感染性子代病毒的減少、病毒DNA復(fù)制產(chǎn)量降低以及病毒多角體的減少。為了深入地揭示桿狀病毒DNApol入核的分子機制,將不同時間點野生型AcMNPV感染Sf9細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,在注釋的序列中鑒定了四個核輸入蛋白α(Importinα)的同源蛋白,結(jié)果顯示SfIMA1/2,SfIMA4和SfIMA7與人類Importinα1,Importinα4和Importinα7分別有46%/26%、69%和64%的氨基酸序列同源性,其中SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7顯示了典型的Importinα家族蛋白的特征,包括在N端存在一個保守的IBB結(jié)構(gòu)域(Importin beta binding domain,IBB)、8個ARM(Armadillo domain,ARM結(jié)構(gòu)域)重復(fù)序列以及C末端的Arm重復(fù)序列。亞細(xì)胞定位分析表明SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7均能定位到Sf9細(xì)胞的核膜。酵母雙雜交實驗證實SfIMA1,SfIMA4以及SfIMA7能與帶有核定位信號的AcMNPV DNApol C末端相互作用。雙分子熒光互補(Bimolecular fluorescence complementation,BIFC)實驗進(jìn)一步證實SfIMA1或SfIMA4或SfIMA7在Sf9細(xì)胞中與AcMNPV DNApol C末端共表達(dá)都有熒光互補現(xiàn)象。這些結(jié)果表明SfIMA1,SfIMA4和SfIMA7這三個核輸入蛋白參與了AcMNPV DNApol核輸入過程。
【圖文】：

圖 1.1 單粒和多粒包埋核型多角體病毒的電鏡觀察[11]。ectronic microscopic analysis of morpholory of single and multiple capnucleopolyhedrovirus[11].毒的復(fù)制

狀病毒的生命周期。(A) 由昆蟲中腸的包涵體釋放的 ODV 感染的中腸在基底方向出芽并引起全身感染。(C)感染早期產(chǎn)生大量 BV，將感染傳播形成并嵌入 OB 中，當(dāng)細(xì)胞破裂時，，OB 釋放。VS：產(chǎn)生病毒的基質(zhì)[25]he life cycle of baculoviruses.(A) OBs are diddolved in the midgut lumen ich infect the midgut cells. (B) BVs bud towards substrate and cause systeme number of BVs are produced and transmit the infection to all the tissueand embedded into OB, releasing when the cells are broken.VS: virogenic s已鑒定出 10 個病毒基因直接參與桿狀病毒核衣殼組裝，vp39并且其余大部分基因編碼小衣殼蛋白，具有各種功能和活動處理 (p6.9、vlf-1 和 vp1054) 磷酸化調(diào)節(jié)(pk1 和 38k)，V-C42 和 vp1054)和細(xì)胞周期調(diào)控 (ODV-EC27)。這些基因的缺的表型。病毒 DNA 復(fù)制并沒有受到影響。未觀察到組裝核衣周或 VS 的星形形狀的內(nèi)部空間內(nèi)積累由主要衣殼蛋白的 VP結(jié)構(gòu)(VP39 缺失突變體除外)。這些空的原噬菌體表明病毒基因
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2589549