【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)和豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus diseases,PCVDs)是影響?zhàn)B豬業(yè)的重要傳染病,其病原分別為豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)。在疫苗免疫壓力下CSFV和PCV2感染豬的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多種變化,有些感染帶毒豬并不表現(xiàn)臨床癥狀,成為重要的傳染源;另外,病毒的變異也可能是疫苗免疫豬再次感染的重要原因。建立敏感特異的檢測方法,可以快速檢測發(fā)現(xiàn)CSFV和PCV2帶毒豬,及時(shí)處理。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種新型的核酸檢測技術(shù),對(duì)病毒核酸檢測具有敏感、特異、操作簡便的優(yōu)點(diǎn),在病毒檢測方面的應(yīng)用研究廣泛。臨床健康的屠宰生豬也可能存在攜帶CSFV和PCV2的情況,通過檢測兩種病原的攜帶率,對(duì)檢測到病毒進(jìn)行遺傳變異分析,可以為養(yǎng)殖場對(duì)CSFV和PCV2的防控提供基礎(chǔ)資料。本研究首先建立了檢測CSFV和PCV2的LAMP方法,從陜西省規(guī)�；i屠宰企業(yè)采集樣品,進(jìn)行CSFV和PCV2的核酸檢測;對(duì)檢測為陽性的樣品進(jìn)行病毒基因擴(kuò)增和序列分析、病毒的分離鑒定。本研究取得以下結(jié)果:(1)建立了檢測豬瘟病毒的RT-LAMP方法和豬圓環(huán)病毒2型的LAMP方法。建立的方法具有較高的敏感性。豬瘟病毒RT-LAMP方法對(duì)病毒RNA最低檢測限為2.58×10~(-7) ng/μL,豬圓環(huán)病毒2型LAMP方法對(duì)病毒DNA的最低檢測限為9.7×10~(-5)ng/μL;而常規(guī)PCR方法最低檢測限分別為2.58×10~(-6) ng/μL和9.7×10~(-4) ng/μL。(2)對(duì)2018-2019年陜西省屠宰生豬豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型進(jìn)行了檢測。2018-2019年,從陜西省采集了來自7個(gè)地區(qū)屠宰生豬樣品300份,用建立的CSFV和PCV2 LAMP方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,CSFV陽性樣品有30份,陽性率為10.0%(30/300);PCV2陽性樣品43份,陽性率14.3%(43/300)。應(yīng)用常規(guī)RT-PCR(PCR)的檢測結(jié)果為CSFV陽性樣品21份,陽性率7.0%(21/300);PCV2陽性樣品38份,陽性率12.7%(38/300)。(3)對(duì)豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型進(jìn)行了基因分析和分型。30份CSFV檢測陽性樣品中的12份樣品克隆獲得了E2基因全長片段,基因分析顯示2株CSFV屬于1.1亞型的石門系強(qiáng)毒株,10株屬于1.1亞型豬瘟兔化弱毒疫苗株,說明目前陜西省豬群中的CSFV還是以1.1亞型為主。43份PCV2陽性樣品中的20份樣品克隆獲得了PCV2 Cap基因全長片段,基因分析顯示,有11株屬于PCV2b亞型,9株屬于PCV2d亞型,說明目前陜西省豬群中的PCV2以2b和2d亞型為主。(4)獲得了豬圓環(huán)病毒2型分離株。從43份PCV2核酸陽性樣品中分離獲得了2個(gè)PCV2分離株,均為PCV2b亞型,分別命名為PCV2/SX-BJ/2019和PCV2/SX-YL/2019,分離毒在感染PK-15細(xì)胞中的滴度分別為10~(-5.5994)TCID_(50)/100μL和10~(-4.7096)TCID_(50)/100μL。
【圖文】：

mmol/L;3.dNTPs concentration 0.6 mmol/L;4.dNTPs concentration 0.8 mmol/L;M.DNAMarkerDL2000.圖2-2 豬圓環(huán)病毒2型LAMP反應(yīng)體系確立Fig.2-2 Establishment of Porcine circovirus type 2 LAMP reaction system

第二章 豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒 2 型 L MP 檢測方法的建立及應(yīng)用的電泳鑒定和可視化觀察 RT-LAMP 檢測反應(yīng)產(chǎn)物的觀察 CSFV RT-LAMP 反應(yīng)體系，反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測暫離心后，陽性管底部有白色沉淀，陰性管底無白色沉淀YBRGreenⅠ核酸染料，觀察到陽性樣品呈現(xiàn)綠色，陰性樣管置于紫外燈下觀察，陽性樣品管有明顯的熒光，陰性。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S851.43

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