【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一種高度致死性急性傳染病,多種家畜和野生動(dòng)物均易感,主要特征為發(fā)熱、奇癢(豬除外)及繁殖障礙。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類動(dòng)物疫病,我國(guó)也將其列為II類動(dòng)物疫病。自從2011年以來(lái),我國(guó)多個(gè)已經(jīng)免疫了PRV gE基因缺失疫苗豬場(chǎng)的豬群出現(xiàn)了類似PR的癥狀,給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2016年11月,吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)某小型豬場(chǎng),母豬出現(xiàn)流產(chǎn)和產(chǎn)死胎的現(xiàn)象,母豬無(wú)死亡病例。仔豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、體溫升高、精神不振、食欲減退以及輕微的神經(jīng)癥狀,新生仔豬發(fā)病率極高,死亡率達(dá)100%,該場(chǎng)從未接種過PRV疫苗。根據(jù)流行特點(diǎn)和臨床癥狀,初步判定為豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病和豬細(xì)小病毒病。為了驗(yàn)證猜想,本研究通過流行病學(xué)調(diào)查、病理組織學(xué)觀察、PCR及RT-PCR技術(shù)、細(xì)菌學(xué)檢查、電鏡觀察、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)等方法從病理學(xué)和病原學(xué)兩個(gè)角度對(duì)該病進(jìn)行了分析和研究。1、病理學(xué)診斷對(duì)送檢病豬進(jìn)行常規(guī)病理剖檢,剖檢發(fā)現(xiàn),送檢病豬的各組織臟器均有不同程度的病理變化:心臟衰竭,左側(cè)心臟較右側(cè)更為明顯;肺臟充血水腫;腸系膜淋巴結(jié)腫大,小腸出現(xiàn)樹枝狀出血;肝臟和脾臟上均出現(xiàn)大量針尖狀灰白色壞死點(diǎn)和壞死灶,此病理變化為豬偽狂犬病的特征性病變。隨后制作石蠟切片,鏡檢發(fā)現(xiàn),肝臟、脾臟均發(fā)生局灶性壞死。肝臟壞死灶內(nèi)有炎性細(xì)胞的聚集,壞死灶周圍肝竇內(nèi)有紅細(xì)胞的淤積;脾臟壞死灶形態(tài)不規(guī)則,中心區(qū)域結(jié)構(gòu)不清楚,鞘動(dòng)脈周圍淋巴細(xì)胞壞死。這與豬偽狂犬病的特征性病理變化相吻合。2、病原學(xué)診斷研磨病料提取DNA,設(shè)計(jì)針對(duì)PRV的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出了與目的大小一致的片段。隨后設(shè)計(jì)針對(duì)豬細(xì)小病毒病和豬圓環(huán)病毒病的特異性引物進(jìn)行鑒別診斷,PCR及RT-PCR的特異性擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,排除了豬細(xì)小病毒病和豬圓環(huán)病毒病的可能性。通過觸片染色方法進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查,排除了細(xì)菌感染的可能性。將感作好的加有雙抗的病料上清液接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離,接種后72h并沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE),隨后我們進(jìn)行了盲傳,當(dāng)盲傳至第8代時(shí),細(xì)胞出現(xiàn)了變圓、折光率增強(qiáng)以及合胞體等典型的CPE現(xiàn)象。此時(shí)收集細(xì)胞病變液,進(jìn)行電鏡觀察。利用Muench法測(cè)TCID_(50),得出該分離毒株的感染滴度為10~(-5.4)/0.1 mL。將細(xì)胞病變液反復(fù)凍融3次,離心取上清接種家兔,3d出現(xiàn)亢奮、奇癢以及輕度的神經(jīng)癥狀,皮膚抓咬破潰,6d內(nèi)全部死亡。對(duì)兔組織進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)增了與出目的大小一致的條帶。剖檢可見腦膜充血,有大量的腦脊髓液;心臟充血,心包內(nèi)有大量積液;肺臟充血水腫。其他臟器并無(wú)明顯的病理變化。鏡檢,肺臟有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁毛細(xì)血管充血;心肌變性,間質(zhì)增寬,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);脾臟淋巴濾泡體積縮小,紅髓間質(zhì)增寬,局部紅髓間質(zhì)內(nèi)可見較多的成纖維細(xì)胞。通過對(duì)PRV感染細(xì)胞和攻毒兔進(jìn)行IFA鑒定發(fā)現(xiàn),接種病毒的BHK-21細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)和攻毒兔腦組織內(nèi)均有紅色熒光的出現(xiàn),這進(jìn)一步證實(shí)了所分離毒株為豬偽狂犬病毒。分離出PRV后對(duì)分離株gE基因進(jìn)行克隆測(cè)序,并進(jìn)行變異性分析、同源性分析以及進(jìn)化樹分析。通過變異性分析,確定該分離株為變異毒株;通過同源性分析,發(fā)現(xiàn)分離株與河南的變異株HeN1株gE基因核苷酸及編碼的氨基酸同源性最高,分別達(dá)99.9%和99.8%;通過進(jìn)化樹分析得出,gE基因主要分為兩個(gè)大分支,本分離株與河南的變異株HeN1株親緣關(guān)系最近。本研究豐富了PRV變異株的遺傳進(jìn)化規(guī)律,為研究和防控豬偽狂犬病打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

.2.3 病理組織學(xué)觀察鏡檢，肝臟局灶性壞死，壞死灶內(nèi)有炎性細(xì)胞聚集，壞死灶周圍肝竇內(nèi)有胞淤積（圖 2.2）。脾臟局灶性壞死，壞死灶形態(tài)不規(guī)則，，中心區(qū)域結(jié)構(gòu)不清動(dòng)脈周圍淋巴細(xì)胞壞死（圖 2.3）。圖 2.1 送檢豬主要眼觀病理特征（A）肝臟針尖狀灰白色壞死灶 （B）脾臟針尖狀灰白色壞死灶 （C）肺臟水腫 （D）腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸樹枝狀充血Fig 2.1 The main pathological characteristics in pigs(A) Liver needle-like gray necrosis (B) Spleen needle-like gray necrosis (C) Pulmonary edema(D) Mesenteric lymph nodes, small intestine dendritic hyperemia

2.2.4 病原學(xué)檢查2.2.4.1 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果經(jīng)革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)，肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的觸片以及培養(yǎng)物中均未檢測(cè)出細(xì)菌。2.2.4.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果利用上述設(shè)計(jì)的針對(duì) PRV 的特異性引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果，可見擴(kuò)增出與 PRV 預(yù)期大小一致的特異性條帶，長(zhǎng)度為 494bp，如圖 2.4。圖 2.2 肝臟局灶性壞死(H&E, 400×) 圖 2.3 脾臟局灶性壞死(H&E, 100×)Fig. 2.2 Focal necrosis of the liver(H&E, 400×) Fig 2.3 Focal necrosis of the spleen(H&E, 100×)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 范克偉;戴愛玲;吳德峰;林煒明;盧馬英;楊小燕;;豬偽狂犬病毒Jiangxi-FZ株的分離鑒定及其重要毒力基因分子特征[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2015年12期

2 葉超;趙款;郭金潮;姜成剛;常曉博;王淑杰;王同云;彭金美;蔡雪輝;田志軍;安同慶;;豬偽狂犬病病毒HeN1株全基因組測(cè)序及感染和毒力相關(guān)基因的變異特征分析[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2015年08期

3 趙雪麗;閆若潛;吳志明;曹偉偉;王淑娟;謝彩華;馬震原;周兵強(qiáng);王東方;;鑒別豬偽狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR診斷方法的建立和應(yīng)用[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2015年04期

4 童武;鄭浩;單同領(lǐng);劉飛;梁超;李國(guó)新;姜一峰;于海;高飛;周艷君;童光志;;偽狂犬病毒變異株(JS-2012)對(duì)仔豬的致病性研究[J];中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào);2014年05期

5 趙鴻遠(yuǎn);彭金美;安同慶;李琳;冷超糧;陳家锃;王倩;常丹;張秋月;蔡雪輝;童光志;田志軍;;豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其gE基因的分子特征[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年07期

6 呂素芳;郭廣君;魏鳳;王文秀;董炳梅;畢研麗;苗立中;沈志強(qiáng);;豬偽狂犬病病毒gE~-/gI~-/TK~-多基因缺失活疫苗對(duì)豬的安全性與免疫效力研究[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年04期

7 顧凡;黃山;劉鵬娟;黃劍波;卓秀萍;朱玲;;豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J];豬業(yè)科學(xué);2014年02期

8 邵定勇;黃紅亮;唐兆新;任常寶;謝小雨;陳瑞愛;;豬偽狂犬病病毒TK/gE雙基因缺失株P(guān)RV/TK~-/gE~-的構(gòu)建及其生物學(xué)特性[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2013年11期

9 史須斌;;豬偽狂犬病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];科技致富向?qū)?2012年08期

10 郭廣君;呂素芳;肖躍強(qiáng);畢研麗;魏鳳;沈志強(qiáng);丁壯;;豬偽狂犬病病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 顧真慶;我國(guó)豬偽狂犬病病毒變異株全基因組序列分析及其gE/gI基因缺失滅活疫苗免疫特性[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 郭廣君;豬偽狂犬病病毒野毒與基因缺失疫苗株鑒別檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 李爽;豬偽狂犬病病毒變異株gE/gl/TK三基因缺失株的構(gòu)建及免疫效力初步研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

2 楊雯慧;河南省PRV血清學(xué)調(diào)查及鑒別野毒/疫苗毒株二重FQ-PCR方法的建立[D];河南科技大學(xué);2015年

3 馬興杰;鑒別豬偽狂犬病毒gE/gB/gG的納米PCR及熒光定量PCR方法的建立及評(píng)價(jià)[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

4 梁苑燕;豬偽狂犬病病毒gE/TK基因缺失株的構(gòu)建及免疫效力的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2012年

5 羅飛;豬偽狂犬病毒結(jié)構(gòu)蛋白gB和gD主要抗原區(qū)的原核表達(dá)以及豬血清PRVgB抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

6 郁宏偉;豬偽狂犬病毒的分離鑒定及檢測(cè)方法的建立[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2588662