【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種感染幾乎所有溫血動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人獸共患病,是至今為止人類病死率最高的急性傳染病之一�？袢〉侥壳盀橹谷詻]有特效治療藥物出現(xiàn),現(xiàn)如今只能在被患病動物咬傷之后盡快暴露后免疫來預(yù)防狂犬病的感染。其中狂犬病病毒G蛋白是唯一一個誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白,在一定程度上可以認(rèn)為疫苗中G蛋白的含量可以決定疫苗的保護(hù)效力。因此建立快速檢測狂犬病病毒G蛋白含量的方法對于疫苗免疫效力的確定及免疫劑量的確定十分重要。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種廣泛使用的免疫學(xué)檢測方法,但是傳統(tǒng)的ELISA仍具有靈敏度相對不足,檢測成本高等缺點。而量子點以其優(yōu)良的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性在生命科學(xué)尤其是體外診斷中的應(yīng)用越來越廣泛,其中與ELISA結(jié)合的方法可以大大提高傳統(tǒng)方法的靈敏度。本研究以ELISA作為基本分析方法,以狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體,以量子點標(biāo)記的糖蛋白單克隆抗體作為檢測抗體,建立熒光免疫吸附法(Fluorescence-linked immunosorbent assay,FLISA)來檢測狂犬病病毒G蛋白含量,對于疫苗抗原含量的效價和免疫劑量的確定具有重要意義。1.狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體的制備與鑒定本研究成功獲得3株抗狂犬病病毒G蛋白的單克隆抗體,分別命名為9F10,1F1和9G10。并對這3株抗體的特性進(jìn)行鑒定,這3株單克隆抗體均為IgG類抗體,其中9F10和1F1為IgG_(2b),9G10為IgG_(2a),而輕鏈均為kappa。染色體檢測結(jié)果9F10的染色體數(shù)目為90,1F1的染色體數(shù)目為89,9G10染色體數(shù)目為97。在間接免疫熒光實驗中3株單克隆抗體均能特異性識別實驗室狂犬病病毒固定毒株SAD、B2c,狂犬病病毒犬源野毒株DRV-Mexico、DRV-HuNPN01,DRV-AH08以及蝙蝠源野毒株SHBRV。在Western blot實驗中,1F1、9F10和9G10均只能識別SAD。在抗原表位鑒定的Western blot實驗中,結(jié)果顯示9G10的抗原位點在239-339 aa之間,9F10與1F1的抗原位點在1-139 aa之間。2.狂犬病病毒G蛋白量子點熒光免疫吸附法FLISA檢測方法的建立通過量子點偶聯(lián)抗體前后表征實驗,結(jié)果表明量子點偶聯(lián)抗體之后能夠正常的激發(fā)熒光,且熒光波長沒有發(fā)生改變,凝膠電泳實驗表明量子點已經(jīng)成功修飾在抗體上。通過配對試驗確定以9F10為捕獲抗體,包被濃度為2μg/mL,以9G10與ZnCdSe/ZnS量子點偶聯(lián)量子點并作為檢測抗體,稀釋度為1:200。用以上包被濃度和抗體稀釋度進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。結(jié)果最優(yōu)封閉液為0.5%BSA+0.05%Tween-20磷酸鹽緩沖液,封閉時間為1 h,樣品稀釋液為1%BSA+0.05%Tween-20磷酸鹽緩沖液,樣品孵育時間為2 h,量子點偶聯(lián)抗體孵育時間為1 h。靈敏性實驗表明FLISA最低檢測限度為1:1600稀釋度,而傳統(tǒng)雙抗夾心ELISA為1:400稀釋度。以梯度稀釋的樣品進(jìn)行檢測,構(gòu)建了用于定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.6176x+7559.5,R~2為0.9719。特異性實驗表明,該方法不會與犬瘟熱病毒,犬細(xì)小病毒以及293T細(xì)胞和BSR細(xì)胞產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。本研究成功獲得3株特異性好的抗狂犬病病毒G蛋白的單克隆抗體,并以此為基礎(chǔ)偶聯(lián)量子點建立熒光免疫吸附法用于檢測狂犬病病毒G蛋白的含量,為今后狂犬病疫苗的效價評估提供一種快速、靈敏的檢測方法。
【圖文】：

檢測狂犬病病毒 G 蛋白含量的熒光免疫吸附對傷口進(jìn)行清洗，接種疫苗，然物學(xué)包膜傳染性粒子，大小為 180 nm 1-1(Fooks and Cliquet 2017)。病螺旋狀核衣殼形成的致密圓柱體穗狀突起的外周囊膜，是病毒的外的不分節(jié)段的單股負(fù)鏈 RNA 基因組，其順序高度保守，從基因組的 5組編碼的五種蛋白質(zhì)分別是核蛋白賴性 RNA 聚合酶蛋白(L)。

圖 1-2 量子點與抗體之間的非共價結(jié)合(Xing et al 2007)A：Ni-NTA 修飾的 QD 與組氨酸標(biāo)記的肽或抗體的結(jié)合B：鏈霉抗生物素蛋白的 QD 與生物素化抗體的非共價合Fig. 1-2 Noncovalent binding of quantum dots to antibodies(Xing et al 2007)A: Binding of Ni-NTA-modified QD and histidine labeled peptides/antibodiesoncovalent binding of streptomyces anti-biotin protein QD and biotinylated antibody價偶聯(lián)抗體的共價偶聯(lián)最常用的結(jié)合方式是使用 1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙酸化物(Ethyl -3- [3- dimethyl aminopropyl] carbonized diimine hydroc聯(lián)劑將抗體和量子點直接偶聯(lián)在一起。該方法的最大優(yōu)點在于大部分的氨基和羧基，在進(jìn)行量子點偶聯(lián)之前不需要對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，體的氨基與量子點的羧基的結(jié)合是隨機(jī)的，如圖 1-3(Xing and Chaudry 應(yīng)中可能會出現(xiàn)一種情況：抗體的抗原結(jié)合位點被結(jié)合在抗體附近的
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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