【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種感染幾乎所有溫血?jiǎng)游锏闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的人獸共患病,是至今為止人類病死率最高的急性傳染病之一�？袢〉侥壳盀橹谷詻]有特效治療藥物出現(xiàn),現(xiàn)如今只能在被患病動(dòng)物咬傷之后盡快暴露后免疫來預(yù)防狂犬病的感染。其中狂犬病病毒G蛋白是唯一一個(gè)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白,在一定程度上可以認(rèn)為疫苗中G蛋白的含量可以決定疫苗的保護(hù)效力。因此建立快速檢測(cè)狂犬病病毒G蛋白含量的方法對(duì)于疫苗免疫效力的確定及免疫劑量的確定十分重要。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種廣泛使用的免疫學(xué)檢測(cè)方法,但是傳統(tǒng)的ELISA仍具有靈敏度相對(duì)不足,檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。而量子點(diǎn)以其優(yōu)良的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性在生命科學(xué)尤其是體外診斷中的應(yīng)用越來越廣泛,其中與ELISA結(jié)合的方法可以大大提高傳統(tǒng)方法的靈敏度。本研究以ELISA作為基本分析方法,以狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體,以量子點(diǎn)標(biāo)記的糖蛋白單克隆抗體作為檢測(cè)抗體,建立熒光免疫吸附法(Fluorescence-linked immunosorbent assay,FLISA)來檢測(cè)狂犬病病毒G蛋白含量,對(duì)于疫苗抗原含量的效價(jià)和免疫劑量的確定具有重要意義。1.狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體的制備與鑒定本研究成功獲得3株抗狂犬病病毒G蛋白的單克隆抗體,分別命名為9F10,1F1和9G10。并對(duì)這3株抗體的特性進(jìn)行鑒定,這3株單克隆抗體均為IgG類抗體,其中9F10和1F1為IgG_(2b),9G10為IgG_(2a),而輕鏈均為kappa。染色體檢測(cè)結(jié)果9F10的染色體數(shù)目為90,1F1的染色體數(shù)目為89,9G10染色體數(shù)目為97。在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)中3株單克隆抗體均能特異性識(shí)別實(shí)驗(yàn)室狂犬病病毒固定毒株SAD、B2c,狂犬病病毒犬源野毒株DRV-Mexico、DRV-HuNPN01,DRV-AH08以及蝙蝠源野毒株SHBRV。在Western blot實(shí)驗(yàn)中,1F1、9F10和9G10均只能識(shí)別SAD。在抗原表位鑒定的Western blot實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果顯示9G10的抗原位點(diǎn)在239-339 aa之間,9F10與1F1的抗原位點(diǎn)在1-139 aa之間。2.狂犬病病毒G蛋白量子點(diǎn)熒光免疫吸附法FLISA檢測(cè)方法的建立通過量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體前后表征實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體之后能夠正常的激發(fā)熒光,且熒光波長(zhǎng)沒有發(fā)生改變,凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明量子點(diǎn)已經(jīng)成功修飾在抗體上。通過配對(duì)試驗(yàn)確定以9F10為捕獲抗體,包被濃度為2μg/mL,以9G10與ZnCdSe/ZnS量子點(diǎn)偶聯(lián)量子點(diǎn)并作為檢測(cè)抗體,稀釋度為1:200。用以上包被濃度和抗體稀釋度進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。結(jié)果最優(yōu)封閉液為0.5%BSA+0.05%Tween-20磷酸鹽緩沖液,封閉時(shí)間為1 h,樣品稀釋液為1%BSA+0.05%Tween-20磷酸鹽緩沖液,樣品孵育時(shí)間為2 h,量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體孵育時(shí)間為1 h。靈敏性實(shí)驗(yàn)表明FLISA最低檢測(cè)限度為1:1600稀釋度,而傳統(tǒng)雙抗夾心ELISA為1:400稀釋度。以梯度稀釋的樣品進(jìn)行檢測(cè),構(gòu)建了用于定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.6176x+7559.5,R~2為0.9719。特異性實(shí)驗(yàn)表明,該方法不會(huì)與犬瘟熱病毒,犬細(xì)小病毒以及293T細(xì)胞和BSR細(xì)胞產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。本研究成功獲得3株特異性好的抗狂犬病病毒G蛋白的單克隆抗體,并以此為基礎(chǔ)偶聯(lián)量子點(diǎn)建立熒光免疫吸附法用于檢測(cè)狂犬病病毒G蛋白的含量,為今后狂犬病疫苗的效價(jià)評(píng)估提供一種快速、靈敏的檢測(cè)方法。
【圖文】：

檢測(cè)狂犬病病毒 G 蛋白含量的熒光免疫吸附對(duì)傷口進(jìn)行清洗，接種疫苗，然物學(xué)包膜傳染性粒子，大小為 180 nm 1-1(Fooks and Cliquet 2017)。病螺旋狀核衣殼形成的致密圓柱體穗狀突起的外周囊膜，是病毒的外的不分節(jié)段的單股負(fù)鏈 RNA 基因組，其順序高度保守，從基因組的 5組編碼的五種蛋白質(zhì)分別是核蛋白賴性 RNA 聚合酶蛋白(L)。

圖 1-2 量子點(diǎn)與抗體之間的非共價(jià)結(jié)合(Xing et al 2007)A：Ni-NTA 修飾的 QD 與組氨酸標(biāo)記的肽或抗體的結(jié)合B：鏈霉抗生物素蛋白的 QD 與生物素化抗體的非共價(jià)合Fig. 1-2 Noncovalent binding of quantum dots to antibodies(Xing et al 2007)A: Binding of Ni-NTA-modified QD and histidine labeled peptides/antibodiesoncovalent binding of streptomyces anti-biotin protein QD and biotinylated antibody價(jià)偶聯(lián)抗體的共價(jià)偶聯(lián)最常用的結(jié)合方式是使用 1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙酸化物(Ethyl -3- [3- dimethyl aminopropyl] carbonized diimine hydroc聯(lián)劑將抗體和量子點(diǎn)直接偶聯(lián)在一起。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)在于大部分的氨基和羧基，在進(jìn)行量子點(diǎn)偶聯(lián)之前不需要對(duì)抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，體的氨基與量子點(diǎn)的羧基的結(jié)合是隨機(jī)的，如圖 1-3(Xing and Chaudry 應(yīng)中可能會(huì)出現(xiàn)一種情況：抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)被結(jié)合在抗體附近的
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2588645