【摘要】：哺乳動(dòng)物腫瘤抑制基因Discs large homologue1(Dlg1),是膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶((m embrane-associated guanylate kinase,MAGUK)家族的一員,通過(guò)PDZ區(qū)與其他分子相互作用參與微管極化,,心體再定向以及細(xì)胞遷移。Dlgl突變時(shí),會(huì)出現(xiàn)微絲和微管的異常組裝而導(dǎo)致的細(xì)胞極性異常,如:柱狀上皮細(xì)胞去極化和細(xì)胞粘附分子的異常分布(呂鴻2010)。小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中Dlgl表現(xiàn)為極性分布,并且這種極性分布與細(xì)胞骨架微絲微管之間存在著密切關(guān)系。本研究以豬卵母細(xì)胞為材料,旨在觀察Dlg1在豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)定位,并在此基礎(chǔ)上通過(guò)RNA干擾技術(shù),引入外源性si RNA,進(jìn)一步研究Dlgl在這兩個(gè)發(fā)育過(guò)程中的作用。試驗(yàn)結(jié)果如下:1、通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)了豬多種組織細(xì)胞中Dlg1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢組織和肺組織中Dlg1的表達(dá)量最高,PEF中表達(dá)量最低。2、免疫熒光染色檢測(cè)豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中Dlg1的蛋白表達(dá)和分布。發(fā)現(xiàn),在GV期豬卵母細(xì)胞中,Dlg1在整個(gè)胞質(zhì)和細(xì)胞核均勻分布,從GVBD~PreMⅠ開(kāi)始到MⅡ胞質(zhì)中Dlg1逐漸向中心聚集,蛋白顆粒更明顯,皮質(zhì)處的分布明顯減少;孤雌激活后的早期胚胎中,Dlg1在整個(gè)胞質(zhì)彌散分布,但表達(dá)量逐漸下降2cell、4cell、囊胚期分別只有MⅡ期的46.9%、58.4%、29.66%。3、通過(guò)QRT-PCR和免疫熒光染色方法來(lái)篩選Dlg1的有效siRNA序列,結(jié)果顯示siRNA-2干擾效率最高,可分別在mRNA和蛋白水平上下調(diào)Dlg1表達(dá)的82.1%和61.28%。4、通過(guò)顯微注射的方法將Dlg1 siRNA-2注射到GV期的豬卵母細(xì)胞胞漿和孤雌激活后2h的胚胎中。結(jié)果顯示:siRNA-2注射組的第一極體排出率為25.2%±3.3%,與對(duì)照組(73.4%±4.7%)相比顯著下降,說(shuō)明下調(diào)Dlg1能顯抑制豬卵母細(xì)胞體外成熟。而且,免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)下調(diào)Dlg1后影響體減數(shù)第一次分裂過(guò)程中微管裝配及紡錘體的形成;siRNA-2注射組的卵裂率和囊胚率分別為73.3%±0.7%和19.8%±1.8%,與對(duì)照組相比(76.9%±2.1%;22.9%±1.35)差異不顯著,說(shuō)明下調(diào)Dlg1不影響豬早期胚胎的卵裂率和囊胚率。
【圖文】：

第一章 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)性的主要分子基礎(chǔ)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂包含兩輪連續(xù)的不對(duì)稱(chēng)分裂，形成一個(gè)大的全能的單體卵和兩個(gè)小的極體，，這種不對(duì)稱(chēng)分裂是由后期開(kāi)始之前卵母細(xì)胞內(nèi)不對(duì)稱(chēng)分裂的發(fā)和發(fā)展決定的，包括不對(duì)稱(chēng)的紡錘體定位、皮質(zhì)分化這兩個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)事件。體外熟時(shí)，生發(fā)泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD）之后，減數(shù)第一次分裂的錘體在細(xì)胞中心形成，染色體排列之后染色體—紡錘體復(fù)合物立刻沿著紡錘體長(zhǎng)軸朝皮質(zhì)一側(cè)起始遷移。伴隨這個(gè)過(guò)程的是將在皮質(zhì)定位的染色體誘導(dǎo)的一系列皮質(zhì)重包括以肌球蛋白環(huán)圍繞富含肌動(dòng)蛋白（Actin）的功能域?yàn)樘攸c(diǎn)的 Actin cap 和皮質(zhì)顆游離結(jié)構(gòu)域的建立、膜微絨毛的消失以及相關(guān)分子的極性累積。紡錘體遷移、定位和質(zhì)重組是卵母細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。到了后期，富含 Actin 的功能域凸出，球蛋白環(huán)收縮導(dǎo)致含有一套同源染色體的第一極體（Polar Body 1，PB1）排出，PB出之后，卵母細(xì)胞進(jìn)入第二次減數(shù)分裂并前進(jìn)到中期（MⅡ），紡錘體在皮質(zhì)下方第次分裂的區(qū)域重新裝配，皮質(zhì)的肌動(dòng)球蛋白域在紡錘體上方與 MⅠ相似的位置建立。在，卵母細(xì)胞完全成熟并阻滯在這個(gè)時(shí)期等待受精（圖 1-1）。

鼠卵母細(xì)胞兩階段染色體遷移和對(duì)稱(chēng)性破壞(Yi et alchromosome migration and aymmertry breaking in m皮質(zhì)極化發(fā)出皮質(zhì)極性建立的信號(hào)（Cap）是對(duì)極體排出必需的結(jié)構(gòu)。當(dāng)減數(shù)第阻滯期間紡錘體不對(duì)稱(chēng)地定位在皮質(zhì)下方時(shí) C86)。先前的研究表明，Cap 結(jié)構(gòu)的建立依賴(lài)于染每一個(gè)染色體團(tuán)分散，皮質(zhì)同樣誘導(dǎo)形成 A有染色質(zhì)）或者精子染色質(zhì)注射進(jìn) MⅡ卵胞質(zhì)003, Deng et al. 2007)，說(shuō)明染色質(zhì)誘導(dǎo)的皮質(zhì)色體或者 DNA 刺激皮質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形成與皮質(zhì)是在一個(gè) 20-25um 的距離內(nèi)，并且誘導(dǎo)皮質(zhì)結(jié)皮質(zhì)極性的‘遠(yuǎn)距離’效應(yīng)與在 Ran 鳥(niǎo)苷三磷成的誘導(dǎo)類(lèi)似，通過(guò)空間上分別行動(dòng)的 Ran 鳥(niǎo)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王靜暉;許淑芳;王曉兵;劉適;王格;周瑞;夏冰;;DLG1基因多態(tài)性與炎癥性腸病遺傳易感性研究[J];河北醫(yī)學(xué);2015年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 呂鴻;不對(duì)稱(chēng)分裂相關(guān)分子在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的作用研究[D];山東大學(xué);2010年

2 王俊超;不對(duì)稱(chēng)分裂分子在鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的表達(dá)和功能研究[D];山東大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 陳瑞;CyclinA2在豬卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂中的作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2585750